邻近标记技术是将一种具有邻近标记功能的酶（如生物素连接酶BioID/BioID2/BASU/TurboID，或过氧化物酶 APEX）与目标蛋白融合，通过酶催化的共价修饰将邻近蛋白标记上生物素（biotin），最后通过亲和素磁珠富集生物素标记蛋白进行质谱鉴定，分析目的蛋白的互作或邻近的蛋白信息。

为什么你的课题，需要邻近标记技术？

做基础科研、转化研究的小伙伴，只要涉及以下课题方向，几乎都绕不开邻近标记技术：

✅ 细胞器蛋白质组学，如绘制线粒体、内质网等特定细胞器蛋白图谱；

✅ 病毒-宿主互作研究，如探索病毒蛋白在宿主内的作用靶点；

✅ 信号通路动态调控，研究信号通路的瞬时/动态调控机制；

✅ 探索肿瘤、神经退行性疾病的关键调控因子；

✅ 鉴定药物靶点邻近蛋白；

✅ 研究膜蛋白、低丰度蛋白、难溶蛋白的功能与互作。

而邻近标记技术，恰好完美适配这些课题需求，凭借其独特优势，成为科研人突破研究瓶颈的核心工具，突破传统Co-IP局限，在生理状态下精准捕捉瞬时、微弱、动态的蛋白质相互作用，还原真实的分子社交网络。

对比早期邻近标记技术，TurboID 也是目前邻近标记技术中综合性能较为突出，且适用于大多数动态互作研究的技术。

邻近标记技术，到底是怎么工作的？

通俗来讲，就是给目标蛋白（诱饵蛋白）“装个小雷达”，让它在活细胞内，主动标记自己周围的所有“邻居”，再通过技术手段把这些“邻居”筛选出来，进行鉴定。

邻近标记技术原理及流程展示

标准化实验实操步骤

1、实验载体构建

以验证蛋白A与蛋白B之间的邻近相互作用为例，常规的、无偏的邻近蛋白组学筛选，只需构建一个表达“目标蛋白-TurboID”的融合载体即可。

2、质粒转染动物细胞（HEK293T）

细胞融合度达70%-80%时转染，转染前更换无血清培养基，按DNA:PEI=1:3配制复合物并静置15-20min，滴加后培养6h更换完全培养基，继续培养48h。

3、生物素标记（核心步骤）

转染48h后，更换含200μM生物素的新鲜培养基，孵育10-30 min后，用预冷PBS洗涤细胞3次去除游离生物素。

4、蛋白提取（细胞/组织）

细胞：预冷RIPA裂解液（加抑制剂）冰上裂解，离心取上清，变性后可WB检测或-80℃保存；

组织：液氮研磨成粉，加裂解液冰上裂解，后续操作同细胞提取。

5、链霉亲和素富集

磁珠洗涤后，加入蛋白裂解上清4℃孵育过夜，洗涤去杂后，用SDS上样缓冲液洗脱蛋白，处理后可WB检测或保存。

6、质谱检测

WB验证有目的条带后，将样品送去质谱检测与分析，明确目标蛋白邻近互作分子。

从高分文献，看邻近标记技术开挂指南

案例一

标题：Wnt target IQGAP3 promotes Wnt signaling via disrupting Axin1-CK1α interaction

期刊：Oncogene

影响因子：7.3

摘要：IQGAP3 在多种上皮癌中高表达并在癌细胞增殖和转移中具有关键作用，但其分子机制尚不明确。本研究利用TurboID 邻近标记技术绘制IQGAP3邻近蛋白图谱，发现 IQGAP3 与 Wnt 通路核心蛋白 Axin1、CK1α互作。机制上，IQGAP3 破坏 Axin1-CK1α结合，从而抑制 β-catenin 磷酸化，最终导致 β-catenin 大量积累；同时 IQGAP3 受 Wnt 通路调控，形成正反馈促癌环路。该研究阐明了IQGAP3 确定为 β-连环蛋白稳定的新型介质，并强调了其作为癌症治疗靶点的潜力。

实验流程

IQGAP3 在 Wnt 信号传导中的作用

案例二

标题：Proximity labeling in neuroscience: decoding molecular landscapes for precision neurology

期刊：Translational Neurodegeneration

影响因子：15.2

摘要：这是一篇神经科学领域邻近标记技术（PL）权威综述，神经系统中复杂的细胞结构和动态分子相互作用长期以来一直挑战着神经系统疾病的机制研究。通过空间限制性生物素标记，以TurboID、APEX2及新型光催化平台为代表的邻近标记技术，可在特定亚细胞区室、细胞类型和细胞 - 细胞界面上，高分辨率绘制蛋白质组与互作组图谱。本文系统总结了邻近标记技术的原理，及其在构建神经系统分子图谱中的变革性应用；重点阐述了该技术如何通过解析阿尔茨海默病、帕金森病等神经疾病的病理机制，彻底改变我们对脑功能的认知；并讨论了该技术如何助力机制型生物标志物与药物靶点的发现，加速基础研究向临床转化，并提出：邻近标记技术能够连接分子神经生物学与治疗创新，推动精准神经病学发展。

邻近标记 (PL) 原理和流程示意图

PL联合应用助力大脑与神经研究

高质量邻近标记技术

我们的邻近标记技术服务（TurboID体系），通过将工程化生物素连接酶（如TurboID）与目标蛋白融合表达，在添加生物素的条件下，酶活催化生物素共价标记邻近内源蛋白，标记产物可通过链霉亲和素磁珠富集，结合质谱或免疫印迹进行鉴定。

技术路线

优势

1. 已建立标准化操作流程（SOP），以293T细胞为例，转染效率高、标记背景低

2. 拥有丰富的细胞培养和转染经验，可承接多种细胞系及原代细胞

3. 提供从载体构建、细胞标记、富集到质谱分析的一站式服务

4. 数据交付完整，包括实验报告、原始数据及生物信息学分析

5. 成功案例：已完成目标蛋白A-TurboID与互作蛋白B的验证实验，经质谱及免疫印迹验证，信噪比良好

案例展示