引言：前面几期的肿瘤与检测科普系列，小编给大家介绍了血液肿瘤中的多发性骨髓瘤（MM）[插入对应链接]和慢性淋巴细胞白血病（CLL）[插入对应链接]，这一期小编继续为大家介绍血液肿瘤中的另一成员：急性淋巴细胞白血病（ALL）。
急性淋巴细胞白血病（acute lymphoblastic leukemia，ALL）是在分化早期受阻的淋巴细胞恶性肿瘤，是儿童中最常见和最可能治愈的恶性肿瘤之一。在儿童中ALL的治愈率>90%，但成人的治愈率仍在30%-40%左右。其中，预后不良的因素包括KMT2A(也称MLL)重排例如t(4;11)/KMT2A-AF4，出现费城染色体t（9；22）BCR-ABL1、C-MYC重排、单倍体等情况，本文主要讲解KMT2A-AF4融合引起的急性淋巴细胞白血病。
基因融合发生机制
在了解KMT2A-AF4融合前，我们先了解基因融合常见的三种发生机制:
1)染色体易位（Chromosomal Translocation）：如图1A中1号和2号染色体上的两片段发生交叉互换，导致1号染色体上的浅绿色基因与2号染色体上的橘黄色基因融合到一起;
2)中间缺失（Interstitial deletion）：如图1B中，3号染色体上的橘黄色基因和浅绿色基因之间的区段发生缺失(deletion)，最终导致这两个基因融合到了一起;
3)染色体倒位（Chromosomal Inversion）：如图1C中4号染色体上的橘黄色基因到墨绿色基因之间的片段发生倒位，最终导致橘黄色基因和浅绿色基因融合到了一起。
KMT2A-AF4基因融合属于第一种情况--染色体易位，即位于11号染色体长臂2区3带的基因KMT2A(也称MLL)与位于4号染色体长臂2区1带的基因AF4发生断裂融合。MLL基因易位断点主要发生在跨越基因第5-11外显子的8.3 kb断裂点簇区,导致MLL基因N末端部分与AF4基因C末端部分融合,形成融合基因KMT2A-AF4, 从而转录融合蛋白。
如图2所示，基因MLL重排存在于急性淋巴细胞白血病(ALL)、急性髓系白血病（AML）和几乎所有混合谱系（或双表型）白血病(MLL)病例中。主要的MLL融合伴侣基因是AF4，主要存在于ALL中;AF9主要见于急性髓细胞白血病;而ENL存在于ALL和AML中。
图2主要MLL融合伴侣基因在新生儿童和成人白血病中的分布(Andrei et.al,2007)
MLL-AF4融合介导的疾病发生分子机制
目前提出的一种常见模型是粘连蛋白复合物与基因组DNA形成称为拓扑关联结构域（TAD）的结构，其包含增强子及其靶基因（图3a）。TAD 边界由收敛的 CCCTC 结合因子结合位点锚定，这些位点充当粘连蛋白的边界，并将增强子-启动子相互作用限制在单个 TAD 内的边界。在此示例中，TAD 1 和 TAD 2 中的增强子-启动子对具有相互作用的能力，但 TAD 1 中的增强子不能与 TAD 2 中的启动子相互作用（图3a、b）。支持这一基本模型的是，α珠蛋白位点上游CTCF结合位点的缺失会产生扩展的亚TAD，导致红细胞中附近基因的异常激活。但目前这种机制仍在研究中，研究者已经提出了几种机制来驱动增强子-启动子的接近，包括共激活因子或染色质蛋白的结合，或粘连蛋白/CTCF 的活性。而在MLL-AF4 结合增强子上，增强子-启动子的接近是由包括 FACT、PAF1C 和 DOT1L 在内的大型 MLL-AF4 复合物组装驱动的。图3d中的FACT为组蛋白伴侣，为RNA聚合酶Ⅱ（PolⅡ）的通过创造有利的条件而促进转录。PAF1C具有高度保守性，与PolⅡ直接紧密结合的转录调控复合物，参与转录调控的多个阶段。DOL1L可调节靶基因转录并经常参与肿瘤增值自我更新侵袭和转移。KMT2A-AF4基因在FACT、PAF1C、DOL1L等的参与下转录KMT2A-AF4的RNA,最终翻译出KMT2A-AF4融合蛋白。
图3增强子功能模型和驱动增强子-启动子接近的因素(Thomas,2024)
MLL融合蛋白可能通过多种机制激活致白血病基因表达程序。鉴于MLL介导H3K4甲基化的结构域(SET结构域)在MLL易位中丢失，并且大多数MLL易位似乎导致Hox和其他基因的表达增加，因此在大多数情况下，其机制似乎并不像H3K4甲基化受到干扰那么简单。
如图4所示，该图显示了组蛋白甲基化的新作用。RNA聚合酶II (Pol II)结合基因的启动子区域，但如果组蛋白核心没有特定的甲基化标记，则无法进行转录（图4a）。独特的组蛋白标记可以在基因的不同区域找到，并可能赋予独特的活性。甲基化转移酶(MLL)是一个多蛋白复合物的成员，该复合物介导RNA聚合酶II占据的基因启动子区域内H3K4的甲基化（图4c）。当启动子区(I)携带组蛋白H3赖氨酸4 (H3K4)甲基化标记时，RNA转录可以启动，当开放阅读框区(II)携带组蛋白H3赖氨酸36 (H3K36)时，RNA转录可以延伸。组蛋白H3赖氨酸79 (H3K79)甲基化标记广泛分布于启动子和开放阅读框区域(III)（图4b）。缺乏SET (Su(var)3-9, zeste增强子，trithorax)结构域H3K4甲基转移酶活性的MLL-AF4融合蛋白融合招募H3K79甲基转移酶DOT1L。MLL-AF4融合介导DOT1L向通常由MLL占据的启动子(如HoxA簇)募集，允许HoxA簇的H3K79甲基化，导致HoxA簇基因的异常表达。HoxA簇的异常表达会导致细胞的增殖、分化和凋亡失衡，从而促进肿瘤的发生。最终导致急性淋巴细胞白血病的发生（图4d）。
图4组蛋白甲基化和转录(Andrei et.al,2007)
荧光原位杂交技术检测KMT2A及其探针设计
目前，检测急性淋巴细胞白血病的技术主要包括流式细胞术、PCR技术、二代测序、蛋白印迹和荧光原位杂交(Fluorescence In Situ Hybridization, FISH)。而FISH技术可以在细胞分裂中期及分裂间期进行,允许对急性白血病特有的结构染色体重排进行更高分辨率的分析，这些结构染色体重排在常规核型分析中无法检测到。此外FISH技术具有着结果直观，可多重染色，特异性强，灵敏度高，对操作人员无伤害，能够用于患者组织和血液检测等优点。
利用FISH技术检测KMT2A有两种探针设计方式。如图5，以MLL（又名KMT2A）基因断裂检测探针（用于MLL基因断裂的检测，断裂两端标记红绿两种颜色）。正常细胞FISH杂交结果应有两个红绿融合的信号点，当细胞中出现一红一绿一红绿融合或两红两绿分开的信号点时，则说明基因KMT2A断裂。
如图6所示，以基因MLL的保守序列设计探针并标记绿色荧光，以基因AF4的保守序列设计探针并标记红色荧光。正常细胞FISH杂交结果应为两红两绿分开的信号点。当红绿信号点融合时，则说明基因KMT2A、AF4发生融合。
图6MLL探针、AF4探针设计及结果解释示意图
综上所述，FISH技术凭借灵活的探针设计与可视化的结果呈现，针对基因组结构变异具有良好的检测效果，但由于该方法不能检测点突变、小片段的插入和缺失以及重复，且具有较高的操作要求和成本，使得荧光原位杂交在临床检测上仍具有一定的局限性。随着技术的不断升级，FISH将成为血液病临床及基础研究的重要手段。
参考文献
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