1. Tm值
F1C、B1C、LF、LB的Tm值65℃（64-66℃）
F3、F2、B3、B2的Tm值60℃（59-61℃）
2. 引物末端稳定性
F3、F2、LF、LB、B2、B3 引物的 3‘ 末端，F1C和 B1C引物的 5’末端 6个碱基的自由能改变值 δG ≤ -4kcal/mol。
3. GC含量
引物GC含量40-65%，最好50-60%。
4. 二级结构
引物设计的时候要防止形成二级结构，这一点是十分重要的，特别是内引物。
5. 引物间的距离
F2引物5‘端到B2引物5'端距离（扩增的区域）约为120--160bp；
F2引物5‘端到F1引物5’端距离（成环的区域）约为40--60bp；
B2引物5‘端到B1引物5’端距离（成环的区域）约为40--60bp；
F3引物3'端到F2引物5’端距离约为0--60bp；
B3引物3'端到B2引物5‘端距离约为0--60bp。
