流程
1 实验设计
1 第一个重要点是去除核糖体RNA（rRNA），要么利用polyA选择性富集mRNA（真核生物mRNA中含有polyA尾结构,因此可以使用oligoT与其特异性的匹配,从而在Total RNA中特异性的富集mRNA），要么除去rRNA（原核生物就只能这样）
2 第二个是测序深度。这主要取决于具体实验的要求，倒没有统一规定。
2 数据分析
原始片段，我们建议异常值＞30%的将被丢弃。
序列比对，例如，我们预计有70%到90%的常规rna测序可以比对到人类基因组上。有参考基因组和转录组的，可以mapping，而没有的话就要组装reads成转录组。
序列组装，太多或者太少reads都不利于组装。无论是有参考还是没有，使用短读Illumina技术完全重建转录组仍然是一个具有挑战性工作，而新兴的长读技术，如来自太平洋生物科学公司的SMRT，提供了足够长的长读序列来为大多数基因排序，这是一个很有前途的替代方案，将在下面的“展望”部分进一步讨论。
差异表达分析，最近的独立比较研究表明，方法的选择(甚至软件包的版本)可以显著影响分析的结果，没有一种方法可能对所有数据集都有良好的效果。因此，我们建议充分记录所使用程序的设置和版本号，并考虑使用多个软件包进行重要分析的重复。
可变剪切分析。
首先，当复制样本数量非常少或基因表达水平非常低时，所有方法的使用都需要特别谨慎。在这些工具中，limma被证明在许多情况下都表现良好，而且它也是运行最快的。DESeq和edgeR在基因排序中表现相似，但在控制FDR时往往相对保守或过于自由。SAMseq在FDR中表现良好，但当复制数相对较高时(至少10 )，SAMseq的敏感性是可以接受的。noiseq和NOISeqBlO (noise eq用于生物复制的适应性)在避免假阳性方面更有效，但代价是牺牲一定的灵敏度，但在不同的重复次数下表现良好。在比较中，Cuffdiff和Cuffdiff2的表现令人惊讶地差。这可能反映了这样一个事实，即在转录水平上检测差异表达仍然具有挑战性，涉及到将reads分配给其他亚型的不确定性。在最近的一项比较中，BitSeq优于其他转录级包，如Cuffdiff2。除了实际性能之外，影响工具选择的其他问题还包括安装和使用的方便性、计算要求和文档质量等。另外一些差异表达工具只能进行两两比较，其他的如edgeR ， limma-voom， DESeq ， DESeq2和maSigPro可以执行多重比较，包括不同的协变量或分析时间序列数据。
未来2个方向
单细胞转录组和长片段测序。
