1材料与方法
1.1选材理由
芦苇(Phragmites communis Trin.)是禾本科多年生草本植物，具有广泛的适.应性并已演化成不同的生态型。本研究采用的两种芦苇生态型分别为沼泽芦苇(Swamp reed)和沙丘芦苇(Dune reed)。2002年，Cui等成功建立了这两种生态型芦苇的组织培养体系，为实验室研究芦苇抗逆性机制提供了很好的材料基础。
1.2实验材料及处理方法
沼泽芦苇和沙丘芦苇的愈伤组织按Cui等(2002)方法获得。在继代培养后，进行分化，使之再生，获得再生植株。挑选生长均一的再生植株，移植在有石英砂的大烧杯中，采用1/2 Hogland营养液，继续培养至五叶期,用于干旱处理。干旱处理方式为自然干旱，将大烧杯中的营养液用吸管完全吸干，在培养室内(温度25°C，湿度40%) 放置6天。对照材料一直保持在1/2营养液中培养。
1.3药品试剂
CHAPS、IPG buffer pH3-10、硫脲来自Amersham Bioscience;尿素Urea (超纯级)、琼脂糖(低溶点)、碘乙酰胺、乙腈、Sequencing Grade Modified Trypsin、丙烯酰胺acrylamide、甲叉双丙烯酰胺Bis、DTT、SDS来自于promega;碳酸氢铵来自Sigma。
1.4含水量测定
取少许芦苇材料置于已称重的Ep管(Go)中，称重(G)，将装有材料的.Ep管放于离心浓缩仪中，65C真空抽干Ih左右，再称重(G2)。含水量(%)= [(G|- CGo)-(G2- Go)]/ (Gi- Go)
1.5叶绿素含量测定
参照Frank等(2005) 的方法测定叶绿素含量。
1.6过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)和超氧化物岐化酶(SOD)活性的测定
称取芦苇对照材料1g，用磷酸缓冲液(0.05mol/L, pH7.2， 含1%PVPP) 研磨匀浆后，4'C，8000rpm, 离心15min， 取上清测酶活力。SOD活力按刘鸿先等(1985) 方法测定; POD、CAT活力按蒋传葵等(1982) 方法测定。
1.7游离脯氨酸含量测定
参照张殿忠等(1990) 方法测定。
1.8芦苇叶片蛋白质提取
全蛋白质提取参照Cui等( 2009 )的分级抽提法和Hurkman和Tanaka( 1986)的酚抽提法进行结合，并加以改进。
将材料加液氮研碎成粉末状，加入少许PVP-40及含50mM Tris-HCl(pH7.8)、10% v/v甘油、1 mM EDTANa2、1 mM PMSF和2% v/vβ-巯基乙醇的抽提缓冲液I继续匀浆。对匀浆液超声两次,每次2s/2s, 10 cycles. 30min后4°C , 22400rpm,离心30min,留上清4C存。沉淀再用含有100mM磷酸缓冲液(pH7.1)、10%v/v甘油、200mM KCl、2mM MgSO4 7H2O、1mM EDTANa2、2%w/v CHAPS、1 mMPMSF和2%v/v β_巯基乙醇的抽提缓冲液II悬浮起来，再对其超声一次(2s/2s,10 cycles)。轻轻摇匀30min后，加入7M Urea、2M硫脲、30mM DTT在室温继续摇匀30min。再22400rpm离心30min，第二次离心得到的沉淀用2%的SDS悬浮，再次用同样的条件离心。三次得到的上清液混合在一起，测定提取蛋白质的含量，按照Cui等(2005)的方法，用BSA作为对照。
对上清液中的总蛋白质进行酚抽提，加入等体积Tris 饱和酚，振荡30min。再离心30min, 15000rpm, 4°C。取酚相再加入5倍体积0.1M乙酸胺(甲醇配制),4C静置至出现沉淀为止。离心30min, 15000rpm, 4C。用丙酮(含13mMDTT)洗涤沉淀两次。最后，-40C冰冻干燥蛋白质成干粉状。
1.9蛋白质双向电泳分离
蛋白质样品制备好后，即可进行双向电泳来分离检测蛋白质。本实验采用的IEF/SDS双向聚丙烯酰胺凝胶电泳(2D-PAGE)。具体操作如下:
用含7M尿素、2M Thiourea、4%w/v CHAPS、40mM DTT、0.5%v/v IPG buffer(pH3-10)和2%o w/v溴芬蓝的样品水化液350ml,室温下充分溶解750μg蛋白质样品。12000rpm 离心5min,取上清参照Huang等(2002)的方法进行一向等电聚焦，使用24cm pH 4-7的线性梯度胶条。在进行二向电泳之前，要对已完成聚焦的胶条进行两次平衡，平衡液中含有50mM Tris-HCl (pH8.8)、 6M尿素、30% v/v甘油、2% w/v SDS以及痕量溴芬蓝，第一次平衡前加1% w/vDTT;第二次平衡前加2.5% w/v碘代乙酰胺(IAA)。 平衡好的胶条转移至SDS-聚丙烯酰胺凝胶上端，并用的0.7%的低熔点琼脂糖封胶(电泳液配制)，其中还含有微量溴酚蓝作为电泳指示带，开始二向电泳分离( Laemmli etal, 1970)。 电泳条件设置为15°C，10mA 每块胶。
蛋白质点检测采用考马斯亮蓝R-250染色,染色后经脱色的凝胶用扫描仪直接扫描。重复实验三次，得到12块凝胶,扫描参数均设置为256阶灰度、300dpi透射扫描，图像保存为TIFF格式。扫描后的图像用ImageMaster 2D Platinum软件(Amersham Bioscience)进行分析，包括蛋白点的检测、匹配等。蛋白点检测.参数设置为: Saliency 为10，Smooth 为8，Min area为8。检测到蛋白质点数约700个。通过比较分析寻找出感兴趣的蛋白点。
1.10蛋白质鉴定及数据库检索
选择软件分析结果显示丰度变化超过2倍以上的蛋白质点进行消化酶解(Cuiet al, 2009)。蛋白质鉴定采用了TOF-TOF MS质谱技术。根据所选取蛋白质点的肽指纹图谱(PMF)和至少一个以上的肽序列标签(PST)信息，根据同源序列大多数芦苇蛋白质都可以得到鉴定。检索结果在NCBI上搜索( www.ncbi.nlm.nih.gov)。
2预期结果分析与讨论
干旱对SOD、POD和CAT三种酶的酶活力都产生了很大影响，POD活力的增强与芦苇抗旱能力正相关。蛋白质组学研究中的最关键步骤是蛋白质的提取和制备。一般而言，植物组织的蛋白质提取分离比动物、微生物更困难。因为植物组织蛋白质含量低，富含蛋白酶,通常还含有一些会影响到下游蛋白质分离鉴定的干扰物质,包括细胞壁、多聚糖、脂类、酚类及大量次生代谢物质(Granier et al, 1988; Geigenheimer etal，1999;Tsugita et al, 1999)。这些污染物是影响2-DE的严重问题，导致出.现横纹、纵纹、污点并减少可见蛋白质点的数目。为了排除这些干扰，已经建立了许多关于植物蛋白质提取分离的技术方法。最常用的有TCA/丙酮提取法和酚提取法。这些方法有效的提高了蛋白质的提取量，可将干扰物含量减到最低，又可避免蛋白酶引起的蛋白质降解。但这些方法有可能使一些水溶性蛋白质丟失,或是导致一些高分子量的蛋白质降解。为了尽可能全面的获取植物组织中的蛋白质，多种蛋白质提取技术相互补充非常必要。 本实验通过两种不同的方法，提取并电泳分离了两种不同生态型芦苇幼苗叶片的蛋白质。分步提取法是提取芦苇蛋白质的首选方法(Cui et al, 2009)。此方法曾用于提取水稻幼苗总蛋白质(Cui et al, 2005), 能提取到大量的中、高分子量的蛋白质，可溶性蛋白和难溶性蛋白。这是由于使用Tris缓冲液，保证了可溶性蛋白质的提取分离;使用了CHAPS、尿素和硫脲等去污剂和离液剂，保证了难溶性蛋白质的提取分离。结果表明，分步提取法能提取芦苇叶片80%的蛋白质，为蛋白质组研究提供了很好的蛋白质样品。
