Primer Premier 5.0引物设计流程

打开软件，单击左上角“File”→“New”→“DNA Sequence”。

复制DNA序列到下图的空白处

图2

复制时会弹出下面的选择框，根据需要进行选择基因的DNA/cDNA序列，在输入框内点击Ctrl+V键，将序列粘贴到对话框中，可以选择正常（As Is），反向（Reversed），互补（Complemented），反向互补（Reversed Complemented），默认为“As Is”，单击“OK”。

图3

2.设置引物搜索参数

在此界面可以看到，基于这个序列可以进行引物设计（Primer），限制酶切点分析（Enzyme）和基序查找（Motif），另外还有一个功能是同源性分析（Allign）。“Translation” →“Protein”，可以将核酸序列翻译成蛋白序列。

其中最常用的功能是引物设计，单击左上角“Primer”

图4

弹出以下页面，再单点击“Search”，进入引物搜索参数设置（Search Criteria）。

图5

引物搜索设置包括：

• 搜索目的：PCR引物（PCR Primers），测序引物（Sequencing Primers），杂交探针（Hybridzation Probes）。

• 搜索类型：可选择上游引物（Sens Primer）搜索，下游引物（Anti-sense Primer）搜索，成对搜索（Pairs），以上游引物为主搜索（Compatible with Sense），以下游引物为主搜索（Comp atible with Anti-sense Primer）。

• 修改搜索范围（Search Ranges）（Sense Primer：正向引物搜索区域，Anti-Sense Primer：反向引物搜索区域，），PCR产物大小（PCR Product Size）。

• 引物长度（Primer Length），（例子：25bp±4bp）

• 搜索方式：自动搜索（Automatic）和手动搜索（Manual）。

可根据实验需求进行参数设置，单击OK。

图6

进入Search Progress界面，再单击OK。

Premier pairs：显示搜索到的引物对数量

图7

3.评估引物参数

搜索结果有上游引物（Sense）、下游引物（Anti-sense）和成对（Pairs）三种方式显示，默认是（Pairs）成对显示。软件按引物的评估等级从高到低进行排列，当前界面可以看到引物的一些简单参数，选中某一对引物后，会出现该引物的详细信息。

图8

• 点击“S”（代表上游引物）或“A”（代表下游引物）可以分别查看上下游引物的具体位置信息，右边显示为PCR产物的位置。

• 表格部分为上下游引物和产物的一些信息，主要包括评估等级（Rating）、长度（Length）、Tm值（Tm）、GC含量（GC%）等。 ΔG（ΔG值是指DNA双链形成所需的自由能，该值反映了引物与模板结合的强弱程度。一般情况下，引物的ΔG最好呈现正弧曲线形状，应当选用3’端ΔG值较低（绝对值不超过9））。其他可以忽略。

• 下方为上下游引物的一些重要指标分析，包括发夹结构（Hairpin），二聚体（Dimer），错误引发情况（False Priming），引物二聚体（Cross Dimer）。“None”代表所分析的引物不存在对应结构的形成，“Found”代表所分析的引物存在对应结构的形成，点击“Found”可以查看该结构的形成情况。

图9

还可以查看单个引物的信息并进行调整。

点左边的S，代表Sense正向，再点Edit Primers。

图10

Edit Primer 框中会显示引物位置、附近的酶切位点、以及其他信息。右键复制即可复制该条引物。可根据相关信息，在红框中调整引物序列。

图11

反向引物的微调同上。

4导出结果数据

4.1导出所选引物对信息

点击File>Print>Current Pair ,

图12

弹出如下窗口，在Print中可以选择上游引物（SensePrimer）或者下游引物（Anti-sensePrimer）或者成对（Primer Pairs），在Secondary Structures（蛋白质二级结构）中选择Most Stable（稳定结构）或者All（所有结构），Secondary Structures针对的时粘贴的为蛋白序列来说的，引物设计不涉及，可忽略（对于DNA序列的引物设计，点击Most Stable或者All都可以，两者最终输出的结果无差异）。然后点击Print。