细胞因子免疫反应词典

1 摘要

1、免疫词典涵盖了 17 多种免疫细胞类型对小鼠淋巴结中 86 种细胞因子（>1,400 种细胞因子-细胞类型组合）中的每一种的反应。以细胞因子为中心的词典视图显示，大多数细胞因子诱导高度细胞类型特异性的反应。例如，炎性细胞因子 IL-1β 几乎在每种细胞类型中诱导不同的基因程序

2、基于该词典，文章开发了配套软件“免疫反应富集分析”，用于从基因表达数据中评估细胞因子活性和免疫细胞极化，并应用于揭示免疫检查点阻断疗法后肿瘤中的细胞因子网络

2 免疫词典

1、为了全面了解细胞对细胞因子的反应，文章系统地分析了小鼠体内淋巴结中 17 种以上免疫细胞类型 86 种细胞因子的单细胞转录组（单细胞 RNA 测序 (scRNA-seq)）反应，以生成大规模的免疫系统扰动 scRNA-seq 数据集，如图 Fig1a

2、将细胞因子或磷酸盐缓冲溶液 (PBS；作为载体对照) 注射到野生型 C57BL/6 小鼠 (每种细胞因子三只独立的重复小鼠) 的腹部皮肤下，注射后 4 小时收集了皮肤引流淋巴结。使用基于液滴的系统（10x Genomics）对细胞进行分析，为 386,703 个细胞生成高质量的单细胞转录组。如图 Fig1b 和 FigS1 FigS2

3、将细胞划分成全局簇后，观察到大多数细胞是根据细胞类型而非刺激条件进行分离的，虽然经细胞因子处理的细胞通常不会形成不同的簇，但它们通常与 PBS 对照细胞在各自的细胞类型簇内分离。如图 FigS1bc

4、刺激后，大多数细胞类型的频率保持稳定，但值得注意的例外是某些细胞因子处理后淋巴结中的单核细胞（monocyte）分数显着增加。如图 FigS1fg

5、补充 Table3 中计算了每种细胞类型中响应细胞因子处理的显著差异表达基因，平均每种细胞因子 - 细胞类型组合鉴定出 51 个 DEG。这记录了 Fig1d 中详细的差异基因信息，包括上调和下调的差异基因

6、为了绘制免疫细胞对每种细胞因子的反应，文章创建了一个图谱，量化了每种细胞类型经细胞因子处理和 PBS 处理的细胞之间的整体转录组变化。某些细胞因子，例如 IFNα1、IFNβ、IL-1α、IL-1β、IL-18、IL-36α、IL-15 和 TNF，在几乎所有细胞类型中都诱导了基因表达的强烈变化。一些细胞因子优先针对某一谱系（例如，IL-21 影响淋巴谱系，而 IL-3 影响髓系）或一组细胞类型。每种主要免疫细胞类型对每种主要细胞因子的转录组反应构成了体内免疫反应词典，称之为免疫词典。如图 Fig1d

该图谱考虑了两个指标：DEG 的数量和整个转录组的变化幅度。DEG 的数量是每个细胞因子特征中的基因总数。细胞因子诱导的差异表达的总体幅度计算为细胞因子处理细胞和 PBS 处理细胞的质心向量之间的欧几里得距离。该值被标准化为从 0（低）到 100（高）的范围.每种细胞类型使用不同的颜色梯度，以强调细胞类型具有不同的特性（例如，平均表达的基因数量不同），并进行独立分析

3 细胞类型特异性细胞因子反应

1、文章对这个词典进行了以细胞因子为中心的分析，以探索不同细胞类型如何响应相同的细胞因子。响应 IFNβ、IL-1β 和 TNF 的 TOP上调基因的基因表达热图显示，细胞因子诱导细胞类型特异性基因表达变化，如图Fig2a

2、文章计算了特定于某种细胞类型或在多种细胞类型之间共享的上调基因的数量。无论定义 DEG 的阈值如何，响应特定细胞因子的大多数上调基因都特定于一种细胞类型，如图FigS3b

3、为了以紧凑的方式表示跨细胞类型的复杂细胞因子反应，文章确定了 gene programmes (GPs) ，它由共表达的基因组成，这些基因在细胞因子刺激下作为一组上调，如图 Fig2c。。IFNα1 和 IFNβ 作为相关细胞因子，诱导彼此高度相似的反应，IL-1α 和 IL-1β 也是如此。正如预期的那样，IFNα1 和 IFNβ 在几乎所有细胞类型中诱导了常见的抗病毒 GP（GP 编号 GP27、GP33 和 GP34），但也诱导了一些谱系特异性和细胞类型特异性程序

4 细胞因子驱动的细胞极化状态

1、文章对字典进行了以细胞类型为中心的分析，以识别由细胞因子诱导的细胞状态。细胞因子是免疫细胞极化的主要驱动因素，一个典型的例子是不同的细胞因子驱使巨噬细胞进入促炎性 M1 样或修复性 M2 样状态

2、在这里，文章利用字典系统地识别单个细胞因子诱导的细胞极化状态。对每种免疫细胞类型进行了亚聚类，并定义了 66 种主要的极化状态，作为细胞因子处理的细胞（相对于 PBS 处理的细胞）显著富集的亚聚类，并表达有意义的生物学程序。如图 Fig3

细胞极化状态的识别：为了识别由细胞因子诱导的细胞极化状态，对每种细胞类型的细胞进行了亚聚类。对于异质性细胞类型（例如巨噬细胞、MigDC 和 γδT 细胞），分析最丰富的均质亚群以识别细胞因子诱导的状态，而不是在极化状态分析中重新推导细胞亚群。使用 PC 根据鉴别基因进行亚聚类，鉴别基因定义为与 PBS 处理的细胞相比，任何细胞因子处理的细胞中具有较大绝对 log 2（FC）（根据细胞类型在 0.75 和 1.5 之间）的基因。计算每个细胞因子或 PBS 对照中落入每个簇的细胞比例。主要极化状态基于以下两个标准进行识别：（1）使用超几何检验，细胞簇中受细胞因子刺激的细胞数量显著（FDR 调整后的P  < 0.01）多于预期的细胞簇；（2）手动验证亚簇中高表达基因或 GP 与诱导变化的细胞因子的生物学相关性

5 细胞因子产生-反应图

1、为了更好地理解每种细胞类型进行的细胞间通讯，文章通过量化所有基线和细胞因子刺激条件下的平均相应转录水平来确定每种细胞因子的产生来源，以解释刺激诱导的表达。如图 Fig4a

2、成纤维细胞网状细胞（FRC）表达的不同细胞因子数量最多，这与之前关于它们在各种免疫和非免疫区室中的异质性和维持功能的发现一致

3、淋巴结中的其他稀有细胞类型，如嗜碱性粒细胞和 ILC，也表达大量细胞因子。免疫细胞类型的丰度与该细胞类型产生的细胞因子数量呈负相关，如图 Fig4b。使用每种细胞类型相同数量的细胞计算细胞因子的产生，以确保可比性。这些发现对于不同的分析参数值都具有稳健性，表明尽管数量很少，但稀有细胞类型是免疫细胞-细胞通讯网络中的关键参与者，如图FigS10b

4、根据从编码每种细胞因子的转录本丰度推断出的细胞因子产生水平和从整体分析中获得的细胞因子反应，文章构建了一个细胞-细胞相互作用组，绘制了免疫系统中可用的细胞-细胞通讯渠道，如图Fig4c。 文章的数据表明，FRC 可以通过产生的多种细胞因子影响几乎所有细胞类型。cDC1 细胞也可以影响几乎所有细胞类型，但通过较少数量的细胞因子，最突出的是通过 IL-1β，它影响许多细胞

6 免疫反应富集分析

1、使用转录组研究免疫过程和疾病已经成为标准，已经产生大量公共数据集。然而，转录组数据并不能揭示触发观察到的细胞状态及其功能的因素，需要一种方法来推断细胞因子反应并揭示基于细胞因子诱导的基因表达程序的细胞 - 细胞通讯网络。大多数从转录组数据推断细胞 - 细胞相互作用的方法都使用配体和受体表达关联。然而，单独的受体表达并不能准确预测细胞因子反应，因为配体可能无法到达细胞或下游通路可能没有功能

2、需要一种计算方法来根据转录组数据自动评估免疫细胞极化

3、为了从任何转录组数据中推断免疫细胞极化和细胞因子反应，文章创建了免疫反应富集分析 ( Immune Response Enrichment Analysis，IREA)，它是免疫词典的配套软件。IREA 通过统计检验来评估转录组中细胞极化或细胞因子特征的富集程度，进而可用于构建细胞间通讯网络，以解释观察到的免疫反应。如图 Fig5ab

4、将IREA应用于已发表的单细胞转录组数据集，该数据集来自接受抗PD-1检查点阻断疗法治疗的小鼠肿瘤中的免疫细胞，如图 Fig5c-e 及 FigS12a-c。IREA自动推断出治疗后的单核细胞和巨噬细胞极化为IFNγ诱导的“Mac-b”（M1样）状态，并远离IL-4诱导的“Mac-e”状态，这与IFNγ极化的M1样巨噬细胞已知的抗肿瘤特性一致。该方法能够在连续的尺度上表征跨多种极化状态的免疫细胞，这与最近关于免疫细胞不是二分极化的观点一致

5、将 IREA 应用于严重的 COVID-19 感染揭示了严重疾病中 B 细胞和 T 细胞对细胞因子的反应，反映了已知的调节淋巴细胞的血浆细胞因子增加，如图 FigS12d

7 IREA 分析

免疫反应富集分析 (IREA) 是免疫词典的配套软件。它将用户基因表达数据与免疫词典参考数据进行比较，以预测用户数据中最活跃的细胞因子。该分析类似于 GO 通路富集分析，但在研究免疫过程方面更加精细。用户数据可以从疾病、治疗、疫苗接种或任何免疫过程中获取

基因列表：
预先计算的已知与目标免疫过程相关的基因列表。例如，用户可以从其数据（从 DESeq2 或 Seurat FindMarkers 获取）中计算差异表达基因列表，并将其输入到框中

基因矩阵：
免疫过程中每个基因的相对表达水平（相对于对照组）

在线网站： https://www.immune-dictionary.org/app/home

7.1 IREA 用于细胞因子反应分析

文章提供两种类型的 IREA 分析选项，可根据输入（可以是基因集或基因表达矩阵）评估用户数据中的细胞因子反应。用户数据中的细胞类型由用户指定。然后，文章会使用以下方法将用户数据与免疫词典中相同细胞类型的转录细胞因子反应进行比较：

1. 对于基因集输入，文章首先通过将每个经细胞因子处理的细胞或经 PBS 处理的细胞中该基因集所有基因的标准化表达值相加来计算基因集得分。使用双侧 Wilcoxon 秩和检验对经细胞因子处理的细胞的基因集得分和经PBS处理的细胞的基因集得分进行统计学显著性评估，并对所有细胞因子计算应用FDR校正。富集度也可以使用超几何检验对显著差异表达基因（经细胞因子处理的细胞和经PBS处理的细胞之间的FDR < 0.01）进行计算，这是通路分析中常用的方法。

2. 对于基因表达矩阵的输入，首先将表达矩阵标准化，使每个细胞的总表达量达到 10,000 个单位；然后对表达量进行对数转换。纳入富集得分贡献显著的基因，默认值为平均表达量超过 0.25 的基因。接下来，通过计算用户输入与经细胞因子处理或 PBS 处理的细胞之间的余弦相似度得分来计算投影得分。使用双侧 Wilcoxon 秩和检验对经细胞因子处理的细胞的投影得分和经 PBS 处理的细胞的投影得分进行统计学显著性评估，并对所有细胞因子计算应用 FDR 校正。效应大小是经细胞因子处理的细胞和经 PBS 处理的细胞的投影得分之间的平均差值。然后 ，可以使用 Fig5d 所示的罗盘图可视化 86 种细胞因子的效应大小和 FDR 调整后的 P 值。从概念上讲，该方法考虑了每个基因表达的方向和幅度。也就是说，如果一个基因在用户数据集和免疫词典参考数据集中都强烈上调，则赋予其高权重，从而增加其富集的总体可能性；如果一个基因在一个数据集中强烈上调，而在另一个数据集中没有强烈上调，则赋予其较低的权重；如果一个基因在一个数据集中上调，而在另一个数据集中下调，则赋予其负权重，从而降低其富集的总体可能性。对富集贡献最高的基因可以通过 FigS12b 中的发散条形图进行可视化

7.2 IREA 用于细胞极化分析

IREA 极化分析采用与 IREA 细胞因子反应分析相同的统计检验方法。在 IREA 极化分析中，用户数据会与极化状态基因表达谱进行比较。如果至少一个细胞极化状态显著富集（FDR 调整后的P  < 0.05），则会显示极化雷达图。如果没有状态显著富集，则雷达图显示每个状态的富集分数均为 0，这表明输入细胞未极化。雷达图上的富集分数被标准化为 0 到 1 之间。

7.3 IREA 用于细胞间通讯网络构建

文章构建了细胞间通讯网络模型，并考虑了细胞因子的产生和应答。通过检测86种细胞因子对应的转录本，获得细胞因子的产生情况。使用 IREA 评估细胞因子应答，并将IREA输出FDR < 0.01的细胞因子纳入。对于由两个亚基组成的异源细胞因子或细胞因子复合物，如果至少一个亚基表达，则该细胞因子显示为表达，因为有证据表明某些成分在胞外组装成功能性细胞因子（方法与细胞间相互作用组相同）。细胞因子网络的可视化如图 Fig5e 和 FigS12c 所示

参考文献

[1] Cui A, Huang T, Li S, Ma A, Pérez JL, Sander C, Keskin DB, Wu CJ, Fraenkel E, Hacohen N. Dictionary of immune responses to cytokines at single-cell resolution. Nature. 2024 Jan;625(7994):377-384. doi: 10.1038/s41586-023-06816-9. Epub 2023 Dec 6. PMID: 38057668; PMCID: PMC10781646.