1. Myocardial infarction promotes the infiltration of myeloid cells in atherosclerotic plaques in ApoE−/− mice
作者首先对ApoE-/-小鼠进行了左前降支动脉ligation，在12周后用免疫组化和流式检测了MI小鼠动脉，发现CD11b+髓系细胞显著增多，且增殖不变，而外周血Ly6Chi单核和CCR2单核均增加(附图)，提示MI小鼠外周血单核细胞增殖并分化成CD11b+髓系细胞进入主动脉。
2. Bone marrow-derived cells from myocardial infarction mice accelerate atherosclerosis
接着作者将Sham或12周MI小鼠的骨髓移植给naive mice(a)，发现移植了MI小鼠骨髓的小鼠，出现显著的动脉损伤(b)，斑块中Cd11b髓系细胞也更多(c-d)。此外，移植了MI小鼠骨髓的小鼠，外周血单核细胞表达促炎因子也更高(e)。
3. Increased expression of SYK in monocytes after myocardial infarction in ApoE−/− mice
接着，作者对sham和MI鼠的外周血单核细胞进行了RNAseq，发现了1460个上调基因和849个下调基因。KEGG获得了20个显著的pathway，并主要与炎症相关(a, b)。其中，SYK (a critical regulator of multiple pro inflammatory genes such as Il1b, Tnf and Icam1)在MI后显著上调(b)。流式和免疫组化都提示MI后外周血单核和斑块中SYK都上调(c, d)，且斑块中的SYK与CD68阳性巨噬共定位(e)。为了探究MI后单核细胞的促斑块作用，作者检测了分别给予chow diet和高脂饮食的sham和MI小鼠，发现MI+HFD小鼠外周血中的Syk, Il1b和Tnf都显著增加(f)。
4.MI induces trained immunity in monocytes via epigenetic reprogramming
由于MI鼠的骨髓可以促进粥样硬化且髓系细胞持续高表达促炎基因Syk，作者推测这个现象是由骨髓来源的细胞的trained immunity所介导的。
甲硫腺苷(methylthioadenosine, MTA)是组蛋白甲基转移酶抑制剂。作者发现使用MTA处理MI小鼠的BMDM可以显著抑制SYK的mRNA和蛋白表达（附图）。因此作者推测组蛋白甲基转移酶可能介导MI时Syk的激活。外周血单核细胞的RNAseq结果中，Kmt5a (H4K20me特异性甲基转移酶基因)出现显著上调 (附图)。H4K20me被报道参与调控基因反式激活，促进细胞周期。此外，作者使用UCSC genome browser寻找人CD14单核细胞SYK基因的组蛋白乙酰化修饰位点的富集情况，发现SYK上存在H4K20me的显著富集(a)，提示H4K20me可能参与MI后单核细胞的反式激活。
接着作者探究了MI小鼠的BMDM是否在oxLDL刺激下增强了SYK的表达。MI小鼠的BMDM在没有oxLDL刺激下，SYK水平没有显著变化，但KMT5A增加，H4K20me增加。而在oxLDL刺激下，这三者的蛋白水平均上调(b)。使用CD或HFD喂养的sham和MI鼠在MI后存在Kmt5a RNA的上调(c)。骨髓造血干细胞MI后的Kmt5a RNA表达也上调(d)。随后作者使用了KMT5A抑制剂UNC0379和SYK抑制剂R406或fostamatibin处理了MI小鼠的BMDM，发现UNC0379处理引起了KMT5A, H4K20me和 SYK蛋白水平的显著下降。而SYK抑制剂显著降低了SYK的表达，对KMT5A和H4K20me的表达没有影响(e)。接着作者使用rVISTA，针对Syk基因序列，设计了针对启动子、增强子和gene body的引物。ChIP-qPCR结果显示，H4K20me主要结合在gene body而不是启动子和增强子区(f)。对CD或HFD喂养的sham和MI鼠外周血单核细胞的ChIP-qPCR结果显示Kmt5a和H4K20me在Syk gene body的富集在CD和HFD的MI小鼠均增加(g)。这些结果提示MI诱导的表观重塑可能引起单核细胞对高脂情况的高反应性。
5. CNBP interacts with KMT5A to promote Syk transactivation in monocytes
转录因子在单核细胞的表观改变过程中起到了决定细胞命运和表型的关键作用。特定DNA序列的组蛋白修饰通常位于组蛋白的尾部，影响染色质的可及性，从而使得转录因子可以靶向特定的DNA序列，调控细胞的转录(参考组蛋白甲基转移酶抑制剂)。
为了探究是否有特定转录因子参与了MI中单核细胞的训练免疫，作者进行了IP-MS实验并鉴定了在MI鼠BMDM中与KM5EA互做的287个蛋白(a)。在与RNAseq的上调基因取交集后，得到了7个蛋白，其中有一个转录因子CNBP(a)。
这个地方不太理解，组蛋白的修饰影响的是染色质的可及性从而影响转录因子与DNA的结合是没错，但是KM5EA是一个甲基转移酶，为什么用它来拉转录因子啊？
接着作者检测了CNBP的表达。有趣的是，MI手术仅在HFD喂养下显著影响Cnbp的表达(b)，在HSC中也一样(c)。Co-IP显示MI手术增强了BMDM中CNBP和KMT5A的互做(d)。通过在293T细胞中过表达CNBP或KMT5A再进行IP也证实了两者的互做(e)。免疫荧光也显示斑块中的巨噬中两者存在共定位(f)。Re-ChIP实验也显示，MI后的HFD增强了Kmt5a-CNBP复合体在Syk基因体的富集(g)。
这些结果提示CNBP可以与KMT5A一起促进单核细胞的训练免疫。
6. CNBP and KMT5A are indispensable for the atherosclerosis post-MI
为了探究KMT5A和CNBP在MI的单核细胞活化和粥样硬化的作用，作者使用siRNA尾静脉注射敲低小鼠的KMT5A和CNBP。
siRNA原来也可以直接打尾静脉啊
结果发现两者均可以减轻斑块面积，降低斑块SYK的表达，降低外周血单核细胞syk, il1b, tnf等促炎基因的表达。H4K20me在Syk基因体的富集也下降。
7. Sympathetic inhibition after MI reduces atherosclerosis and arterial inflammation
焦虑，疼痛，心梗后的心功能恶化都可以激活交感神经系统。越来越多的证据表明MI后的交感兴奋可以触发骨髓中HSCs的活化和释放，引起外周单核细胞的增加。因此作者推测交感神经兴奋对MI后粥样硬化的进展至关重要。
为了阻断外周交感神经递质的释放，作者使用6-OHDA (a neurotoxin that depletes the peripheral sympathetic nerves) 处理了MI小鼠(a)。发现腹腔注射了6-OHDA的MI小鼠粥样硬化斑块缩小(b)。斑块中CD11b+细胞数量减少(c)，促炎基因表达也下降(d)。流式结果显示给予6-OHDA的小鼠，外周血髓系细胞、Ly6chi单核，CCR2+单核，SYK+单核均下降。
8. In vitro norepinephrine stimulation parallels trained immunity post-MI in monocytes
接着作者使用NE处理了小鼠BMDM以激活交感神经系统，探究了其对MI的影响(a)。发现NE处理的BMDM中，SYK, KMT5A, CNBP均上调(b)。随后作者在NE处理的BMDM中分别加入1uM的酚苄明(non-selective a-blocker)和1uM的propranolol (non-selective beta-blocker)，发现两者均可阻断NE诱导的Syk, Kmt5a和Cnbp的表达(c)。此外，ChIP-qPCR结果显示NE处理的BMDM和NE加ox-LDL处理显著加强了KMT5A和H4K20me在Syk基因体的富集，Re-ChIP显示BMDM中KMT5A-CNBP在Syk基因体的富集仅在oxLDL处理后出现(e)。
9. SYK+ monocytes were increased in STEMI patients with advanced coronary lesions
最后作者在患者上做了验证，发现单核细胞中SYK的高表达与心脏缺血后更高的粥样硬化burden相关。
