影响因子：7.3
研究概述：软组织肉瘤(STS)是一种起源于间质组织的高度异质性恶性肿瘤，约占人类恶性肿瘤的0.72%~1.05%。早期治疗主要以手术为主，5年生存率为60%至80%。然而，超过一半的患者会出现局部复发或远处转移。晚期的STS治疗策略有限，基于蒽环类药物的化疗是标准的一线治疗，但反应率低。免疫疗法是一种刺激宿主免疫系统对抗恶性肿瘤细胞的治疗方法，在多种癌症中显示出积极的效果，并改善了难治性肿瘤的治疗效果。虽然STS免疫治疗在部分组织学类型中已取得一定疗效，但整体情况仍令人担忧，需要进一步探索STS肿瘤免疫微环境，寻找更有效的免疫治疗策略和预后生物标志物。三级淋巴结构(TLS)是与淋巴结结构特征相似的大型淋巴组织。它们发生在非淋巴组织中并伴有持续炎症，如慢性感染、器官移植、自身免疫性疾病和癌症部位。TLS是产生效应免疫细胞、塑造肿瘤免疫微环境、促进T细胞和B细胞产生有效免疫应答的关键位点。TLS是肿瘤免疫微环境的重要组成部分，对患者的预后和免疫治疗反应具有重要意义。然而，TLS在软组织肉瘤中的潜在机制尚不清楚。本研究旨在系统地探索了TLS及其相关基因是否可以作为预测软组织肉瘤预后和免疫治疗效果的有用生物标志物。
研究流程如下：
研究结果：
4个TLS特征的建立和相关性分析
基于已发表的文献，作者通过GSVA算法估计了4个TLS特征(Total_gene, 12-gene, 9_gene, Hallmark-gene)。箱形图结果显示，在Hallmark-gene，12-gene和9_gene的得分中，Total_gene的TLS得分丰度处于中等水平(图1A)。而进一步的相关分析表明，Total_gene的TLS评分与Hallmark-gene，12-gene和9_gene评分具有较强的相关性，它们的相关性系数分别为0.93、0.96和0.81(图1B)。接着，作者利用“ESTIMATE”算法计算了每个样本的免疫评分(immune score)、基质评分(stromal score)和肿瘤纯度(tumor purity)，并进一步分析它们与4个TLS评分的相关性。结果显示，Total_gene的TLS评分与免疫评分、ESTIMATE评分和基质评分相关性最高，相关系数分别为0.92、0.9和0.7 (图1C，所有P值均小于0.05)。然而，Total_gene的TLS评分与肿瘤纯度、RNAss和DANss呈较高的负相关性，相关系数分别为-0.9、-0.11和-0.16(图1C, P < 0.001, P = 0.011和P = 0.071)。作者随后进一步用MCPCOUNT算法计算了免疫细胞的丰度，发现Total_TLS_gene与T细胞、CD8+T细胞、细胞毒性评分、NK细胞、B细胞、单核细胞、内皮细胞和骨髓树突状细胞的相关系数分别为0.74、0.78、0.71、0.5、0.53、0.78、0.58和0.17(图1D; 除中性粒细胞、内皮细胞和成纤维细胞外，其余P<0.05)。
同样地，在TIMER2.0数据库中也发现了类似的结果，即在Total_gene的TLS评分中，免疫细胞的丰度优于其他三个TLS评分，这表明Total_gene的TLS评分能够更准确地反映STS中TLS浸润的水平。作者根据以往的研究将STS患者分为5个肿瘤亚型，其中在TCGA-SARC队列中未发现C5亚型。作者对5种不同免疫亚型的TLS评分进行了分析。结果显示，C2 (IFN-γ主导的)亚型的TLS评分最高，其次是C6 (TGF-β主导的亚型)、C3 (炎症型)、C1 (伤口愈合型)和C4 (淋巴细胞耗竭型)亚型(图1e, 所有P值均小于0.05)。该结果表明TLS评分与免疫激活和刺激能力有关。
高、低TLS亚型的临床特征及差异基因富集分析
作者根据总基因TLS评分，将总共256个STS样本平均分为TLS-H和TLS-L两个亚组（表1）。卡方检验结果显示，TLS-H组表现为年龄较大(P = 0.001)，男性患者较多（P < 0.001），未分化脂肪肉瘤(DDL)较多，平滑肌肉瘤(LMS)比例较低(P <0.001)以及患者死亡率较低(P = 0.029)的特征(图2A，B)。在比较不同组织学亚型之间总基因TLS评分时，作者发现DDL和粘液纤维肉瘤(MFS)具有较高的TLS评分，其次是未分化多形性肉瘤(UPS)，LMS和其他亚型(图2A)。同时，存活的STS患者的总基因TLS评分高于死亡患者(图2B, P = 0.008)。此外，与TLS-L患者相比，TLS-H患者拥有更好的总体生存(图2C，P=0.013)。
随后，作者在TLS-H和TLS-L亚组之间选择了96个差异表达基因(DEGs）（图2D，E；|log2FC| > 2.0, FDR < 0.05）。KEGG富集结果显示，这些DEGs主要参与免疫相关途径(图2F)，如“细胞因子-细胞因子受体相互作用”，“T细胞受体信号通路”和“Th1和Th2细胞分化”。此外，作者探讨了临床特征(年龄和性别)和总TLS评分的无进展生存期(PFS)之间的关系。结果表明，老人和男性的TLS评分更高(补充图5A-C)，这可能是由于慢性炎症刺激导致的，但其潜在机制尚不清楚。此外，作者还比较了TLS-H和TLS-L亚型之间免疫细胞浸润的比例。结果显示，与TLS-L亚型，TLS-H亚型中的T细胞、B细胞和巨噬细胞浸润更高，而TLS-L亚型中的纤维细胞浸润更高(补充图5D, E)。
TLS相关基因预后风险评分的构建与验证
作者将256个STS样本随机分为训练(n = 128)和测试(n = 128)队列。结果显示，年龄，性别，TLS亚型，组织学，生命状态和残留肿瘤等临床特征无显着差异。随后，作者采用单因素和LASSO-Cox回归分析筛选出了5个预后显著的基因，分别是DUSP9, TNFSF14, COL2A1, EDN3和KCNQ2(图(3A-C)。而通过多因素COX分析，作者最终确定了两个与TLS相关的预后基因—DUSP9和TNFSF14(图3D, E)。图4A结果显示，在训练队列中，风险评分升高的患者死亡生命状态的比例较高，同时伴随着较高的DUSP9表达和较低的TNFSF14表达(图4A)。在测试队列中同样发现了类似的结果(图4B)。在绘制生存曲线时发现，风险评分较低的患者不论是在训练队列或者测试队列中都拥有更好的总体生存益处(图4C, E)。
评分和临床特征的预后价值评估
作者接下来应用了ROC曲线来评估预测患者1年总生存的准确性。结果显示，在训练队列中，风险得分的AUC值最高，其次是残留肿瘤(0.639)、年龄(0.527)和性别(0.464) (图4D)。而测试队列结果与训练队列结果类似，风险得分的AUC值最高为0.665，其次是残留肿瘤(0.614)，年龄(0.592)和性别(0.497)。作者根据年龄、性别、肿瘤残留等临床信息进一步调整风险评分，森林图结果显示，训练集和测试集的风险评分是患者总生存的独立风险因素(图4G, H)。
单细胞数据集中STS的肿瘤微环境分析
接着，作者分析了18个免疫相关基因与TNFSD14、DUSP9、Total_gene TLS评分和风险评分之间的相关性。图5A的相关热图显示，TNFSF14和Total_gene的TLS评分与18个免疫相关基因存在显著正相关，而DUSP和风险评分呈显著负相关(P < 0.05)。此外，TNFSF14和Total_gene的TLS评分与T细胞、B细胞、CD8+T细胞和树突状细胞呈显著正相关，而DUSP和风险评分呈显著负相关(图5B, C; P < 0.05)。作者随后进一步探索了单细胞数据集中STS的免疫微环境(GSE212527队列)。结果发现，平滑肌肉瘤(LMS)的肿瘤微环境主要由9个簇组成，包括T细胞、B细胞、巨噬细胞、成纤维细胞等(图5D)；而未分化多形性肉瘤(UPS)主要由10个簇组成，包括T细胞、B细胞、单核细胞、NK细胞等(图5G)。在UPS和LMS样品中，DUSP在巨噬细胞和内皮细胞簇中高表达(图5E, H)，而TNFSF14仅在T细胞簇中表达(图5F, I)。该结果表明，TNFSF14可能有助于T细胞发挥抗肿瘤免疫调节作用。
USP9和TNFSF14在不同STS亚型中的表达及免疫治疗反应分析
作者比较了不同STS亚型之间风险评分、TNFSF14和DUSP9的差异。结果显示，TNFSF14在DDL、MFS和UPS中高表达，在LMS和其他亚型中表达下调；而风险评分和DUSP9则相反(图6A-C)。为了进一步分析DUSP9和TNFSF14的免疫治疗反应，作者收集了两名接受免疫治疗联合抗血管生成药物治疗的局部晚期肺泡软组织肉瘤(ASPS)患者的原发部位肿瘤和转移组织，这些患者符合临床特征。免疫组织化学结果显示TNFSF14在细胞质中阳性表达，DUSP9在肿瘤细胞核中阳性表达，棕黄色染色被认为是阳性(图6D)。正如预期的那样，原发性肿瘤组织和肺转移的染色显示TNFSF14作为预后保护因子呈阳性表达，DUSP9作为预后危险因子呈阴性表达。此外，作者进一步研究了这两个关键基因在公共队列STS免疫疗法缺陷中的免疫反应。结果显示，与SD/PD亚型相比，CR/PR亚型患者TNFSF14表达较高，而DUSP9表达较低(补充图6A, D)。同时，TNFSF14表达较高(补充图6B, C)或DUSP9表达较低(补充图6E, F)的患者总生存和无进展生存期较好。这些结果表明高TNFSF14和低DUSP9可能是更好的免疫治疗反应的潜在生物标志物。
STS免疫细胞分布的流式细胞术分析
为了阐明STS肿瘤微环境中免疫细胞浸润的丰度，作者利用流式细胞术检测了DDL和LMS肉瘤中不同比例的免疫细胞。结果显示，DDL中CD3、CD8、CD19和CD11c阳性免疫细胞的浸润显著增加，表明T细胞、B细胞和DC在其微环境中的浸润水平显著高于LMS(图7)。这些结果表明，DDL的肿瘤微环境以活化免疫细胞类型的浸润为主。
TNFSF14过表达抑制肉瘤细胞的增殖和迁移
为了确定TNFSF14在肉瘤中的功能作用，作者利用过表达质粒载体在SW872和HT1080细胞中过表达了TNFSF14。Western blots验证了TNFSF14的过表达(图8A)。结果表明，过表达TNFSF14显著抑制了SW872和HT1080细胞的增殖(图8B, C)。Transwell实验结果显示，过表达TNFSF14显著抑制了SW872和HT1080细胞的迁移和侵袭(图8D-G)。
研究总结：
本研究从生物信息学、临床特征和细胞学实验等方面对TLS及其相关基因进行了系统的探索。DUSP9和TNFSF14的表达可能影响三级淋巴结构的功能，调节局部免疫反应，促进免疫细胞浸润。DUSP9和TNFSF14与STS免疫微环境的相互作用可能是肿瘤逃逸的关键。深入研究发现TNFSF14与免疫细胞浸润基因TLS评分和风险评分呈正相关，TNFSF14可能是预测软组织肉瘤预后和免疫治疗疗效的潜在生物标志物。除此，DUSP9和TNFSF14对免疫治疗(尤其是免疫检查点抑制剂)应答的影响值得进一步研究。然而，该研究存在局限性，包括样本量小、数据来源存在潜在偏倚、未充分考虑肿瘤微环境复杂性和患者特异性免疫状态等因素。
