多蛋白共表达策略设计——2A肽、IRES、Furin肽与多启动子策略

本节概览

一、IRES：独立翻译的经典方案
二、2A肽：核糖体跳跃实现近等摩尔表达
三、Furin肽：高尔基体中的精准切割
四、多启动子：独立转录单元
五、组合策略：Furin-2A联用系统
六、四种策略对比与选择建议

引言

在基因功能研究和生物制药生产中，常常需要同时表达两个甚至多个外源蛋白——CAR-T细胞中的嵌合抗原受体与共刺激分子、单克隆抗体的重链与轻链、iPSC重编程中的Yamanaka四因子组合、以及CRISPR编辑系统中的Cas9与效应蛋白。当这些蛋白需要在同一细胞中协同工作时，如何在载体上合理地排列和表达它们，就成为直接影响实验成败的关键设计问题。

目前，主流的共表达策略可分为两大类：单启动子多顺反子策略（包括IRES、2A肽和Furin肽）与多转录单元策略（多启动子）。前者利用一个启动子驱动一条mRNA，通过不同的翻译机制产生多个蛋白；后者则为每个蛋白配备独立的启动子和调控元件。这两类策略在表达均一性、蛋白末端保真度、载体容量和构建复杂度上各有取舍。

本文将系统梳理IRES、2A肽、Furin肽和多启动子四种策略的分子机制、适用场景和内在局限性，并重点介绍一种整合了2A肽与Furin肽各自优势的组合方案——Furin-2A联用策略。

一、IRES：独立翻译的经典方案

IRES（内部核糖体进入位点，Internal Ribosome Entry Site）是最早被广泛应用的共表达策略之一。

机制：在同一个启动子驱动下，一条mRNA上包含多个开放阅读框（ORF）。上游ORF通过经典的5′帽依赖机制翻译；下游ORF则依赖位于其上游的IRES序列直接招募核糖体小亚基，在不依赖5′帽结构的情况下启动翻译。

序列特征：常用的脑心肌炎病毒（EMCV）IRES长约500–600 bp，具有复杂的二级结构。商业载体中常见的“IRES2”并非标准术语，而是特定载体（如Clontech的pIRES2系列）的命名习惯——可能代表工程化改造版本，但在一些载体中与普通IRES序列差异极小，不能简单默认“IRES2效率更高”，应以具体载体图谱为准。

优点：

• 两个蛋白的氨基酸序列完全独立，上游蛋白C端和下游蛋白N端均无额外残留氨基酸。这一特性使其适用于对末端完整性格外敏感的蛋白——例如，某些受体蛋白的C端参与信号转导复合物的组装，末端延长的氨基酸可能破坏其功能。

局限性：

• 表达量严重不均：下游ORF的翻译依赖IRES招募核糖体，效率远低于5′帽依赖翻译。下游蛋白的表达量通常仅为上游蛋白的10%–50%。如果实验需要两个蛋白严格按1:1比例表达，IRES通常无法满足。
• 序列长：500–600 bp的额外序列增加了载体的大小负担，在容量受限的递送系统（如AAV）中不占优势。

适用场景：适用于以表达上游蛋白为主、下游蛋白仅作为筛选标记或辅助表达的场合，以及对蛋白末端纯净度有极高要求的场景。

二、2A肽：核糖体跳跃实现近等摩尔表达

2A肽是目前共表达实验中应用最广的策略，因其能以最小的序列代价实现最接近等摩尔的蛋白表达。自1999年Ryan等人提出“核糖体跳跃”模型以来，2A肽的机制、变体效率和应用策略已积累了丰富的文献数据。

机制：2A肽是一种顺式作用元件，其编码序列将多个蛋白连接在同一个ORF内。核糖体翻译至2A肽C端的甘氨酸-脯氨酸（Gly-Pro）肽键时，肽基转移酶中心发生空间位阻，导致该肽键无法正常形成——核糖体“跳跃”跳过该键的合成，但继续翻译下游序列。其结果是，前体蛋白在2A肽C端位置被“断裂”为两个独立的多肽链。这一过程并非蛋白水解切割，而是翻译过程中肽键形成的失败。Donnelly等人（2001）通过FMDV 2A位点突变分析进一步阐明了这一机制的关键氨基酸残基。

序列特征：2A肽仅长约18–22个氨基酸（DNA序列约54–66 bp），序列极短。

常用变体及其效率

在哺乳动物细胞中，四种常用2A肽的效率排序已有多项独立研究证实为：P2A > T2A > E2A > F2A。

关键实验证据：

• Kim等人（2011，PLoS ONE）** 在HEK293T、HT1080、HeLa三种人源细胞系以及斑马鱼和小鼠中系统比较了四种2A肽的切割效率。Western blot和荧光蛋白定位分析一致证实，P2A在所有检测条件下切割效率均为最高。
• Souza-Moreira等人在酵母系统中提供了定量参考值（添加GSG接头后）：P2A约85%，T2A约56%，E2A约46%，F2A约43%。该排序在哺乳动物细胞中同样成立，但具体数值可能因细胞类型和检测方法而异。
• 2017年Scientific Reports上的系统比较**在双顺反子、三顺反子和四顺反子载体中进一步验证了这一效率排序。
• Szymczak等人的系列研究证实，F2A和T2A在哺乳动物细胞中的活性高于E2A，而P2A在后续研究中表现优于所有其他变体。
• 另有报道指出，ERBV-1（马鼻炎B病毒来源的2A肽）在某些条件下切割效率接近100%，但其应用远不如P2A广泛。

特殊场景——CHO细胞：在生物制药常用的CHO细胞表达体系中，2A肽的效率规律与通用规律不同。一项2015年发表于mAbs的研究发现，带GSG接头的T2A（GT2A）在CHO细胞中切割效率最高，抗体表达水平最佳。该研究同时强调：没有任何一种2A肽能实现100%完全切割。因此，在CHO细胞中进行抗体生产时，应优先测试GT2A，而非直接沿用P2A。

影响效率的关键因素

• GSG接头：在2A肽上游添加Gly-Ser-Gly（GSG）接头可显著提升切割效率，尤其对T2A和E2A效果明显。上述效率数据均基于添加GSG接头的版本。Minskaia等人的研究表明，2A肽长度的修饰也会影响切割活性。
• 上游序列上下文：2A肽之前的基因序列会影响核糖体与切割位点的相互作用，同一2A肽在不同融合伴侣下游的切割效率可能存在差异。
• 基因位置效应：在多顺反子载体中，位置越靠后的基因表达量通常越低，这一梯度效应可能叠加在2A肽切割偏倚之上。
• 细胞类型依赖性：效率因宿主细胞类型而异——如CHO细胞中GT2A优于P2A即为典型案例。

优点：

• 近等摩尔表达：上下游蛋白由同一ORF翻译，核糖体跳跃后两者以接近1:1的摩尔比产生。这一特性对需要精确化学计量比的蛋白复合物（如抗体、TCR-CD3复合物）的表达极为重要。
• 序列短，易于构建：约60 bp的长度远小于IRES，载体容量压力显著降低，适合多基因串联表达。Liu等人的研究表明，将不同2A肽串联（如P2A-T2A）可进一步提高整体切割效率，并减少未切割产物的比例。

局限性：

• 末端氨基酸残留：上游蛋白C端会残留约20个2A肽氨基酸残基，下游蛋白N端则多出一个脯氨酸残基。这些残留氨基酸在某些情况下可能影响蛋白的折叠、定位或功能。
• 切割效率非100%：所有2A肽均无法实现完全切割。在关键实验中，必须通过Western blot验证实际切割比例和未切割前体的含量。
• 多基因串联时的同源重组风险：在同一个载体中使用多个相同2A肽序列时，重复序列可诱发同源重组导致质粒不稳定。应使用不同来源的变体（如P2A+T2A+E2A组合）加以避免。de Lima等人（2021，Viruses）的系统综述对2A及2A样序列在病毒中的分布和生物技术应用进行了全面梳理，可供设计多基因串联方案时参考。2025年发表于Cell Reports的一项研究通过系统鉴定预测了约2,200种2A肽序列，并发现了新的Class B类别，为未来的变体选择提供了更广阔的空间。

适用场景：广泛应用于CAR-T细胞构建、多亚基蛋白复合物表达、CRISPR编辑器中Cas9与效应蛋白的共表达等需要近等摩尔共表达的场景。对于胞质蛋白和核蛋白，由于末端残留耐受性较好，2A肽通常是首选。

三、Furin肽：高尔基体中的精准切割

Furin肽是一种利用细胞自身蛋白酶系统实现蛋白切割的策略，切割后上游蛋白C端保留完整的Furin识别序列。

机制：在两个蛋白之间插入Furin蛋白酶的识别序列。当前体蛋白经内质网-高尔基体分泌途径转运时，定位于高尔基体反面膜囊的Furin蛋白酶识别并切割该序列。Furin的切割位点位于识别序列最后一个精氨酸（R）的羧基端，因此切割后识别序列本身保留在上游蛋白的C端。Hasegawa等人（1992，J Biol Chem）对Furin进行了纯化和鉴定，明确了其Kex2样加工内切蛋白酶的性质。

序列特征：Furin的核心识别基序为Arg-X-Lys/Arg-Arg（RXK/RR），也能识别并切割Arg-X-X-Arg（RXXR）序列，只是效率可能略低。典型的强识别序列为RRKR（Arg-Arg-Lys-Arg），仅4个氨基酸，极为短小。

优点：

• 切割精确：Furin在高尔基体中以高特异性识别并切割靶序列，切割位点明确。
• 2A残留移除：在与2A肽联用时，Furin可切除2A肽跳跃后残留的长链氨基酸序列，避免约20个外源氨基酸残基对蛋白A的干扰。

局限性：

• 上游蛋白C端保留识别序列：切割后，Furin识别序列（如RRKR）完整保留在上游蛋白C端。对于大多数分泌蛋白和膜蛋白，C端多出四个氨基酸通常影响有限，但对某些对末端完整性要求极高的蛋白（如末端参与特定蛋白互作），这仍可能构成风险。
• 依赖亚细胞定位：Furin蛋白酶主要定位于高尔基体，因此该策略仅适用于经过分泌途径的蛋白（分泌蛋白、膜蛋白、高尔基体/溶酶体蛋白）。对于胞质蛋白和核蛋白，前体蛋白不会与Furin接触，切割不会发生。
• 切割效率依赖序列上下文：即使RRKR序列本身被Furin高效识别，若两侧蛋白的空间结构遮挡识别位点，或识别位点周围的氨基酸不利于蛋白酶结合，切割效率可能下降。

适用场景：单克隆抗体重链和轻链的共表达、双特异性抗体设计，以及需要从融合蛋白中释放天然末端分泌因子的场景。Fang等人（2013，Biotechnol Lett）已证实Furin-2A序列在慢病毒载体中可有效实现scFv抗体片段与报告蛋白的共表达。

四、多启动子：独立转录单元

多启动子策略的逻辑最为直接——为每个基因构建一个完整的独立转录单元。

机制：在同一载体上，每个基因各配备一套完整的启动子（比如CMV与EF1A）、编码序列和polyA信号。各转录单元之间彼此独立，每个基因的mRNA分别转录和翻译。

优点：

• 每个基因的转录和翻译完全独立，理论上互不干扰。
• 各基因可使用不同的启动子，实现差异化表达强度。

局限性：

• 表达不均一：不同启动子在特定细胞类型中的活性差异可导致各蛋白表达量严重失衡。即使使用相同的启动子序列，启动子之间的“转录干扰”效应（相邻启动子互相抑制转录）也可能导致某基因表达被抑制。
• 载体容量压力大：每个基因需一套完整的启动子和polyA信号，载体总长迅速膨胀。以双基因表达为例，仅启动子（如CAG约1.7 kb + PGK约0.5 kb）和polyA（两份约0.5 kb）即占据约2.7 kb空间，超过许多病毒载体的有效包装上限。
• 位置效应敏感：各转录单元在载体上的相对位置可能影响表达水平，优化布局通常需要通过实验逐个测试。

适用场景：当两个蛋白的表达需要不同的调控模式（如一个组成型表达、另一个诱导型表达），或当蛋白对末端残留异常敏感且不走分泌途径时。

五、组合策略：Furin-2A联用系统

鉴于2A肽和Furin肽各自的优势与局限——2A肽保证近等摩尔表达但留下长达约20个氨基酸的末端残留，Furin肽可实现精确切割但受限于分泌途径——将两者联用成为合理的技术整合。这一策略最早由Fang等人（2013）在慢病毒载体中验证了可行性。

设计原理：在蛋白连接处，将Furin识别序列（如RRKR）置于2A肽序列的上游，形成“蛋白A—Furin位点—2A肽—蛋白B”的排列。翻译时，核糖体首先在2A肽处发生跳跃，将前体蛋白“断裂”为两端：蛋白A-RRKR-2A残留，以及带有N端脯氨酸的蛋白B。随后，若融合蛋白经过高尔基体，Furin在其识别序列RRKR的最后一个精氨酸（R）之后进行切割，将2A肽残留序列从蛋白A上切除，但RRKR四肽本身保留在蛋白A的C端。

序列结构：

Protein A — RRKR ↓ — 2A peptide — Protein B
                     ↑ Furin切割位点（最后一个R之后）

切割后的最终产物：

优势整合：

• 2A肽负责“近等量”：核糖体跳跃机制保证了蛋白A与蛋白B以接近1:1的摩尔比产生。
• Furin负责“去尾”：Furin切割将2A肽残留的长链氨基酸序列从蛋白A上移除，避免了约20个外源氨基酸对蛋白A的潜在干扰。但需注意，蛋白A的C端会保留RRKR四个氨基酸。

局限性：

• 蛋白A C端保留RRKR四肽：与单独使用2A肽相比，Furin切割将蛋白A C端的残留从~20个氨基酸缩短为4个氨基酸（RRKR）。对于抗体等大多数分泌蛋白，这一短标签通常可接受；但对某些对C端完整性极为敏感的蛋白，四肽标签仍可能影响功能，需在设计中加以考量。
• Furin切割不完全：Ng等人（2025，Scientific Reports）在CHO细胞中证实，Furin-2A策略存在Furin切割不完全的问题，部分蛋白仍会残留完整的2A肽段。实际应用中可通过优化Furin位点两侧序列或共表达Furin酶来改善。
• 依赖分泌途径：与单独使用Furin肽相同，此策略仅适用于经过高尔基体的分泌蛋白和膜蛋白。

最新研究支持：Ng等人（2025，Scientific Reports）在CHO细胞表达体系中系统比较了多启动子、IRES和Furin-2A三种策略对抗体轻链和重链共表达的影响。结果显示，IRES在多顺反子策略中表达更均一，但总体抗体分泌量较低；Furin-2A联用策略在表达均匀性和总产量上均优于IRES和多启动子方案。该研究同时指出，Furin切割不完全是需要关注的实际问题。

适用场景：单克隆抗体的高效表达、双特异性抗体设计、CAR结构中的多链共表达，以及任何同时要求近等摩尔表达和缩短末端残留的分泌/膜蛋白共表达场景。对于C端极度敏感的蛋白，需评估RRKR四肽标签是否影响功能。

六、四种策略对比与选择建议

策略综合对比

选择决策路径

选择共表达策略时，建议依次回答以下问题：

1. 目标蛋白是否经过分泌途径（分泌蛋白或膜蛋白）？

   • 是 → 优先考虑Furin-2A联用，可获得近等摩尔表达并将上游蛋白C端残留缩短为四肽标签（需验证Furin切割效率，并评估RRKR标签对蛋白功能的影响）。
   • 否 → 进入下一步判断。

2. 两个蛋白是否需要精确的近等摩尔表达（如1:1配对）？

   • 是 → 选择2A肽（哺乳动物细胞首选P2A，CHO细胞首选GT2A），接受约20个氨基酸的末端残留，并通过Western blot验证实际切割效率。
   • 否 → 进入下一步判断。

3. 是否对蛋白末端的氨基酸残留极为敏感（如C端参与关键蛋白互作）？

   • 是 → 选择IRES或多启动子，接受表达不均一或载体容量的代价。
   • 否 → 2A肽仍是最便捷的通用方案。

策略选择速查表

总结

从IRES到2A肽，从Furin切割到两者的巧妙联用，多蛋白共表达策略的演进本质上是在解决一个核心矛盾：如何以最小的序列代价和末端修饰，实现最接近等摩尔的蛋白产出。不同的策略并非简单的优劣之分，而是在表达均一性、末端保真度和实验便利性三个维度上的差异化取舍。

2A肽以其~60 bp的极小序列实现了近等摩尔的共表达，但其切割效率受变体类型、GSG接头、上游序列和细胞类型等多重因素调控。在哺乳动物细胞中P2A为首选，而在CHO细胞中GT2A表现更优——这一细胞类型依赖性表明，任何通用规则都需在具体实验体系中验证。重要的是，所有2A肽均无法达到100%切割，在关键实验中通过Western blot验证实际切割效率是不可省略的质控环节。

Furin-2A联用策略也是不错的选择，它利用2A肽的核糖体跳跃机制保证近等摩尔，再借助Furin的高尔基体切割将上游蛋白C端的残留从~20个氨基酸缩短为RRKR四肽标签。这一策略并非实现无痕切割，而是在“长尾残留”与“短标签”之间做出了更优的权衡。对于抗体等大多数分泌蛋白，C端四肽标签通常可接受；但对某些对末端完整性要求极高的蛋白，IRES或多启动子仍是更安全的选择。

总之，在实验设计中，我们需要理解每种策略背后的分子机制，根据目标蛋白的亚细胞定位、末端功能敏感性和表达化学计量比需求做出合理选择。

主要参考文献

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