周五组会上，大家乱成一锅粥。导师正拿着一篇「综述」愁眉苦脸感叹道：「经费、样本、时间，都打水漂了呀！」
师妹：难怪 WB 实验结果总跳，还以为是人品问题！
师弟：天啊！我的转基因鼠、我的抗体、我没日没夜配的胶！
师姐：我还以为是大家的实验操作问题，让师弟师妹们优化样品、跑胶、转膜、曝光，真的没有想到是内参的问题。
原来，本次混乱的起因是一篇综述文章，于 2024 年 9 月发表在Ageing Research Reviews，题目为 Resolving the current controversy of use and reuse of housekeeping proteins in ageing research Focus on saving people’s tax dollars。实验室最常规的 Western 实验，竟因为内参的不当使用，而沦为经费的「吞金兽」。
图源：文献截图
WB 实验中，很多实验人员认为管家蛋白（如 β-actin、GAPDH 和 Tubulin）的表达量稳定一致，常常用作内参，所以千方百计地想把内参跑平。然而，这篇综述指出这些所谓「稳定」表达管家蛋白并非在所有条件下都稳定，不同的细胞类型、发育阶段，以及衰老、压力、药物或刺激治疗下管家蛋白的表达均会发生变化。如：
β-actin 的表达可能受到细胞应激的影响；
GAPDH 水平可能在糖酵解氧化应激/线粒体条件下变化。
这也意味着我们之前做过的大量 WB 实验结果可能并不准确，为了获得一张跑平的内参，以及符合预期的目的条带，实验人员不得不反复实验，既浪费了时间和精力，又耗费了课题组的实验经费，使得 WB 沦为「实验黑洞」。
由于这些潜在的可变性，验证每个特定实验条件下管家蛋白的稳定性至关重要。为了提高 Western 实验的成功率和结果准确度，作者提出了 4 个解决方案，以此减少对单一管家蛋白的依赖，并减少重复实验的时间以及费用成本：
正式实验前，通过 WB 预实验来评估管家蛋白表达的一致性；
采用其他定量技术，如定量 PCR 或质谱，来确定管家蛋白的 mRNA 或蛋白水平；
管家蛋白的分子量应与实验目标蛋白的分子量有所区别，避免条带重叠；
凝胶电泳的运行条件，包括是否使用梯度或固定浓度，需要提前考虑；
此外，该论文还推荐了「总蛋白染色技术」以替代传统内参，总蛋白染色适用于广泛的样本类型，消除了传统内参蛋白表达量容易受影响的问题。这种染色方法不仅具有成本效益，易于使用，而且与不同样本兼容（包括管家蛋白表达不稳定的样本）。同时，不用过多考虑电泳条件，不需要将传统内参与目的蛋白进行分离，被推荐作为 Western Blot 实验中的一种更优的内参方法。
Stain-Free 技术，正是一种总蛋白染色方法，Stain-Free 成像技术利用含有专有三卤化合物的聚丙烯酰胺凝胶，通过短暂的光活化直接使凝胶中的蛋白质产生荧光，无需额外染色步骤即可在电泳和 WB 过程中立即可视化蛋白质。它不依赖于单一的蛋白质内参，而是利用荧光标记来检测凝胶或印迹膜上的总蛋白含量。
省时省钱：WB 结果双保险
1、Stain-Free 技术：简化实验的荧光标记法
Stain-Free 技术的核心在于利用荧光染料对凝胶或印迹膜上的总蛋白进行标记，从而实现对样品加载量的直接和定量评估。
这种方法的优势在于其快速性和灵敏性，能够在不依赖于特定蛋白质内参的情况下，提供一种全面的蛋白质负荷视图。
2、Stain-Free 技术：省心省力的多重优势
与传统的总染色方法相比，Stain-Free 技术具有操作简便、节省时间和成本的优势。
操作简便性：Stain-Free 技术避免了传统染色的复杂步骤，使得实验操作更加快捷和简便。
时间和成本效率：无需额外染色，减少了实验时间，同时降低了试剂使用成本，提高了实验的经济性。
结果准确性：Stain-Free 技术提供了总蛋白水平的均匀性验证，确保了样品加载量的一致性，从而提高了实验结果的准确性和可靠性。
举个例子，研究中传统内参蛋白 Vinculin 的条带在实验中表现出不一致的变化，而 Stain-Free 技术所显示的总蛋白水平则表明样品加载量是均匀的。
图片来源：参考文献 2
依赖单一的 Vinculin 作为内参，研究者可能需要对样品加载量进行调整，这不仅增加了实验的操作复杂性，而且可能会引起目标蛋白表达量的不准确定量，进而影响实验结论的可靠性。因此 Stain-Free 展示的总蛋白成为 WB 实验的第二保险。
参考文献
[1]. Resolving the current controversy of use and reuse of housekeeping proteins in ageing research: Focus on saving people's tax dollars. Ageing Res Rev. 2024 Sep
[2]. Di Leo L, Pagliuca C, Kishk A, Rizza S, Tsiavou C, Pecorari C, Dahl C, Pacheco MP, Tholstrup R, Brewer JR, Berico P, Hernando E, Cecconi F, Ballotti R, Bertolotto C, Filomeni G, Gjerstorff MF, Sauter T, Lovat P, Guldberg P, De Zio D. AMBRA1 levels predict resistance to MAPK inhibitors in melanoma. Proc Natl Acad Sci U S A. 2024 Jun 18;121(25):e2400566121
