CO-IP新方法

用BioID2 邻近标记（Proximity Labeling）临近细胞提高CO-IP效率

1. 核心工具：BioID2 是什么？

• BioID2 是一种工程化的生物素连接酶（biotin ligase），通常基于大肠杆菌的 BirA 酶进行突变优化（BioID2 是第二代版本，比第一代 BioID 活性更高、半径更小、更适合活细胞使用）。
• 它被融合（fusion）到目标蛋白上（如 CASP5A 或 CASP5C），同时带有一个 MYC 标签方便检测。

2. 工作原理（步步拆解）

1. 融合蛋白表达：

   • 通过慢病毒转导（Lentiviral transduction） 把 CASP5-BioID2 融合基因导入人类结肠类器官（human colonic organoids）中，让类器官细胞稳定表达这个融合蛋白。

2. 添加生物素（Biotin）触发标记：

   • 细胞培养时加入外源生物素（biotin）。
   • BioID2 酶会利用 ATP 把生物素共价连接（biotinylation） 到附近蛋白的赖氨酸（Lysine）残基上。
   • 关键特性：标记范围很小，通常只有 10–20 nm 半径（相当于一个蛋白复合物的物理距离）。这意味着只有与 CASP5 直接接触或非常靠近的蛋白才会被标记。

3. 为什么能捕获互作蛋白？

   • 传统 Co-IP（免疫共沉淀）容易丢失瞬时、弱相互作用，且需要裂解细胞后进行。
   • BioID2 是在活细胞内（in vivo） 实时标记，能捕获生理状态下的瞬时或空间邻近蛋白（包括 Dishevelled/DVL）。
   • 即使相互作用很短暂，只要在生物素存在期间发生，就会被“永久” biotin 标记下来。

4. 后续检测：

   • 用链霉亲和素（Streptavidin）或 Avidin 进行 pull-down，把所有被生物素标记的蛋白拉下来。
   • 通过质谱（Mass Spectrometry） 鉴定这些蛋白，得到与 CASP5 邻近的蛋白列表（图1g 很可能就是这个结果，DVL1/2/3 高排名）。
   • 图1f 右侧的免疫荧光图像主要是展示融合蛋白在类器官中的表达和定位（绿色/蓝色可能是 Phalloidin 标记肌动蛋白骨架 + DAPI 标记细胞核，红色可能是 anti-MYC 标记融合蛋白）。

3. 图1f 中的具体设计

• 左侧示意图：对比 CASP5A-BioID2（含 CARD 域）和 CASP5C-BioID2（缺 CARD 域），目的是比较不同亚型各自的邻近蛋白网络。
• 这是一种发现型（discovery）实验：先用 BioID2 筛选出潜在互作伙伴（hit 如 DVL），再用 Co-IP、Western blot 等验证型实验确认（图1i、j、k 等）。

优点与局限（便于你理解实验可靠性）

• 优点：能在类器官这种接近生理的 3D 模型中进行，捕捉活细胞内的动态互作。
• 局限：标记是不可逆的，可能会有假阳性（过于靠近但不直接互作的蛋白也会被标记），所以需要后续验证。

简单比喻：把 BioID2 想象成一个“带标签喷漆的小机器人”，它被绑在 CASP5 身上，只要周围 10–20 nm 内有蛋白路过，就给它喷上生物素漆。然后用磁铁（链霉亲和素）把所有喷了漆的蛋白吸出来分析。