表观遗传学包括在不改变 DNA 序列的情况下染色质的可遗传结构和生化改变 。表观遗传机制通过改变局部和全局染色质的表观遗传密码的可及性来调节相关基因表达，从而操纵各种生理和病理过程。

目前，三种主要的表观遗传密码已得到充分研究，包括DNA甲基化、组蛋白修饰和非编码RNA (ncRNA)。

癌症是一种由细胞分裂控制中的遗传和表观遗传改变引起的复杂疾病。癌症基因组学和表观基因组学领域的发现增加了我们对致瘤过程的起源和进化的理解，极大地增进了我们对癌症分子病因学的了解。因此，任何当代癌症研究观点都必须将肿瘤发生视为一种细胞现象，是遗传和表观遗传突变之间相互作用以及它们与环境因素（包括我们的微生物组）相互作用的结果，影响细胞代谢和增殖率。对这些过程的整合和更好的了解将有助于我们改善诊断、预后以及未来的遗传和表观遗传疗法。

接下来给大家分享一篇以表观遗传学结合转录组筛选癌症新型甲基化驱动基因的实例。

研究背景

肺癌是全世界癌症死亡的主要原因，非小细胞肺癌 (NSCLC) 约占肺癌的85%，尽管有新药治疗 NSCLC 患者，但5年生存率仍为15%。先前人们针对 NSCLC 的治疗制定了多种治疗策略，如顺铂化疗联合抗血管生成贝伐单抗，使用酪氨酸激酶抑制剂治疗EGFR突变、ALK或ROS1重排的NSCLC患者。然而，由于这些药物的原发性、适应性和获得性、耐药性，靶向治疗并不是对所有NSCLC患者都有效。

DNA 甲基化改变通常发生在癌症中，并参与肿瘤的发生和进展。异常启动子CpG甲基化为癌症中抑癌基因和癌基因的调控提供了一种选择性机制，而不是基因突变。然而，与基因突变相比，这些甲基化变化本质上可以被药物逆转。因此，表观遗传调节基因的鉴定为表观遗传治疗和新药物靶点的发现开辟了新途径。

研究结果

1.肺癌中全基因组DNA甲基化的变化

研究者首先收集 NSCLC 患者的18 例肺肿瘤组织和邻近正常组织，提取这些组织的基因组DNA，进行亚硫酸氢盐测序 (RRBS) 。并使用Trim Golore对数据进行预处理。这里共鉴定出2574098个CpG位点，去除异质体中的CpG位点，并与单核苷酸多态性数据库重叠，其余CpG位点用于下游分析。为了评估RRBS的重现性，研究者比较了每个样本之间的全基因组CpG甲基化值。选择所有样本中变化最大的前 1% CpG 位点来执行无监督分层聚类（图1A）。使用所有 CpG 位点的主成分分析 (PCA) 也显示两组之间有类似的分离（图1B）。这些结果表明 NSCLC 和正常组织之间存在显著的甲基化差异，且观察到 NSCLC 内的变异远大于正常样本内的变异（图1B )，表明 NSCL中存在肿瘤内 DNA 甲基化异质性。

图1

2.癌症特异性高甲基化区域主要发生在胚胎干细胞中具有稳定启动子的基因上

与匹配的正常组织相比，肿瘤中共检测到4410个高甲基化DMRS（hyperMe-DMRs）和4824个低甲基化DMRs（hypoMe-DMRs）（图2A）。研究发现在肺癌中发现了类似数量的低甲基化和高甲基化，这与之前关于结肠癌的报道一致。虽然在肺癌中同时发生了高甲基化和低甲基化的变化，但在基因组区域和活性状态上存在显著差异。大多数（75.5%）的hyperMe-DMRs位于CGI内，而只有16.1%的hypoMe-DMRs与CGI重叠（图2A）。此外，通过整合由5个组蛋白修饰标记生成的ESC表观基因组中15个染色质状态的分析，研究者发现hypoMe-DMRs在ESCs的平衡启动子中强烈富集，而hypMe-DMRs在整个活性状态中没有显示出显著的富集（图2B-E）。

图2

3.肺癌中的 HyperMe-DMR 在各种原发性癌症和癌细胞系中反复出现高甲基化

从TCGA 21种癌症的甲基化阵列数据中研究hyperMe-DMRs中CpG位点的甲基化水平，研究者发现肺癌数据中hyperMe-DMRs 在TCGA肺癌和其他原发性肿瘤中仍然是高甲基化（图3A）。此外，通过ENCODE 和CCLE数据库研究者发现这些hyperMe-DMRs 的甲基化水平与来自ESCs、外周血的原代细胞、原代培养细胞系和来自NIH表观遗传组学蓝图的原代组织相比，均有显著增加（图3B）。

图3

4.与ESC活性启动子标记基因相比，ESC平衡启动子标记基因的DNA甲基化与基因表达的相关性更强

有2519个（57.1%）hyperMe-DMRs位于启动子内，包括两种类型：一种是其启动子在ESCs中染色质状态平衡（2033,46.1%），另一种是在ESCs中染色质状态活跃（486,11%）（图2B）。例如，IRX1和MAPK7启动子中的hyperMe-DMRs分别被二价态和活性态靶向，显示了ESCs中不同的染色质修饰（图4A）。此外，用19901个蛋白编码基因对两种hyperMe-DMRs进行了注释，获得分别有995个ESC平衡标记基因和307个ESC活性标记基因。通过整合与相应的RNA-seq数据的分析，发现在肺正常和肿瘤组织中没有或低转录水平的基因中显著富集，而ESC活性标记基因在这些基因中没有显著富集（图4B）。在肺正常和癌症组织中表达的393个ESC平衡标记基因和187个ESC活性标记基因中，ESC平衡标记基因中下调的基因大于ESC活性标记基因（图4C）。综上所述，研究结果表明，ESC平衡标记基因的甲基化水平比ESC活性标记基因更能预测其转录水平。

图4

5.综合分析确定了肺癌中八个新的甲基化基因

研究发现了一个包括190个蛋白质编码基因的基因列表。为了进一步减少假阳性发现率，还使用包括LUAD和LUSC在内的TCGA队列中肺癌样本的甲基化和表达数据集筛选了主要候选基因列表。最终在LUAD和LUSC TCGA队列样本中获得了31个独特的基因，包括20高甲基化驱动和11低甲基化驱动基因（图 5A）。在这里，研究关注列表中的20个高甲基化驱动基因进行后续分析。20个高甲基化驱动基因的甲基化状态与其表达呈显著的高度负相关（图5A）。

20个基因中有12个是之前在肺癌中描述的甲基化驱动基因（图5A），其余8个基因是肺癌中新发现的甲基化驱动基因，包括5个已知的癌症甲基化驱动基因（HSPB6、IRX1、ITGA5、PCDH17、TBX5）和3个以前未报道过的新基因（ADCY8、GALNT13和TCTEX1D1）。此外，使用焦磷酸测序验证了在23个独立的肺肿瘤和匹配的正常组织中，8个新的甲基化驱动因子的甲基化变化的可重复性（图 5B）。在一个独立的肺癌队列中，8个新的甲基化驱动因素可以区分肺肿瘤和正常样本，曲线下面积（AUC）为0.965（图5C），这表明这8个基因可能是一个潜在的肺癌诊断生物标志物。

图5

6.肺癌中新型甲基化驱动基因的功能验证

PCDH17在正常脾脏、大脑和肺中的表达较高，可能是由于这些组织中其启动子的活性组蛋白标记。然而，对于其他组织和细胞类型，它们的启动子区域通常被活性和抑制性组蛋白标记（染色质平衡状态）的组合所靶向，导致它们的表达较低（图6A）。来自TCGA队列的HM450中的两个探针被映射到DMR（图6A）。与正常样本相比，探针和DMR的甲基化水平的升高与肺肿瘤中基因表达的降低显著相关（图6B）。研究者还发现Calu1、H1299和HOP62细胞中，PCDH17的表达强烈上调（图6C），表明PCDH17的表达受到启动子甲基化的调控。PCDH17在A549细胞中的表达量是4个细胞系中最高的，这可能解释了为什么在5-aza-dC处理后没有观察到显著的表达变化（图6D）。此外，由于HOP62也有较高的PCDH17表达量，因此选择了这两种细胞系来抑制PCDH17的表达。接着研究者对其在肺癌中的功能作用进行了实验研究(图6E-G)。

图6

7.ncRNAs及其宿主基因的共同表观遗传控制

研究者在蛋白编码基因和lncRNAs中均观察到TSS和TES区域的DNA甲基化缺失，转录区域的DNA甲基化富集，但在miRNAs中DNA甲基化水平较低（图7A），接着进一步研究了lncRNAs与邻近编码基因的三个亚型（基因间、基因内和反义）是否存在差异的甲基化谱。与其他类型的lncRNAs相比，在基因间的lncRNAs中只观察到更多的DNA甲基化富集（图7B）。这些结果表明，lncRNAs与蛋白质编码基因具有相似的甲基化模式，但三种类型的lncRNAs具有不同的甲基化谱，这可能影响了它们的调控作用。此外，研究鉴定了8个lncRNAs和5个miRNAs的甲基化与表达之间存在显著的负相关。其中3个通过启动子高甲基化与宿主基因共同调控，包括miR-218及其宿主基因SLIT2、miR-490及其宿主基因CHRM2、CDO1-LNC及其宿主基因CDO1（图7C）。此外，相应的miRNA-seq和RNA-seq数据的生物信息学分析启动子甲基化可能是miR-218及其宿主基因调控的一种选择性调控机制（图7D-F）。

图7

8.肺癌中新型甲基化驱动基因的功能验证

为了确定哪些基因受到NSCLC中相应转录因子结合附近的强烈影响，研究者通过整合靶基因表达与pDMRs甲基化水平和TFs表达水平的相关性来计算活性评分（图8A-B）。发现了EGR1结合基序中的两个CpG位点的甲基化水平与TCF21的表达之间存在显著的相关性（图8C），EGR1的表达也与TCF21的表达水平高度相关（图8D）。

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文章小结

研究结果表明，RRBS是探索癌症甲基化组的有效且稳健的方法。这里研究鉴定并通过实验证实了一组在肿瘤发生、促进和进展中发挥关键作用的甲基化驱动基因（例如PCDH17、IRX1、TBX5和HSPB6），还揭示了 ncRNA 及其宿主基因的共同表观遗传控制，这些控制由相同的启动子高甲基化控制。这项研究还为未来识别基于DNA甲基化的诊断生物标志物、开发癌症表观遗传疗法和研究癌症发病机制提供了宝贵的资源。

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