### 一般从测序公司拿到的下级数据有raw data，或者经过质控之后的clean data，格式为fq。参考基因组及注释文件gff从网上下载。分析流程如尾图所示。
分析软件bwa、samtools、bcftools、annovar通过conda install安装。
bwa 得到sam文件
```
conda install bwa
bwa index /mnt/d/Desktop/S288C_genomic.fna
bwa mem /mnt/d/Desktop/S288C_genomic.fna /mnt/d/r_1.fq.clean.gz /mnt/d/r_2.fq.clean.gz > aln-pe.sam
```
···
samtools 得到bam、bcf文件
conda install samtools
···
samtools faidx /mnt/d/Desktop/S288C_genomic.fna #sam文件转换为bam文件
samtools view -bS -1 /mnt/d/Desktop/YEAST/aln-pe.sam > test.bam
samtools sort /mnt/d/Desktop/YEAST/test.bam -o test.sort.bam #bam文件排序
samtools index /mnt/d/Desktop/YEAST/test.sort.bam #为bam文件建立索引
samtools depth /mnt/d/Desktop/YEAST/test.sort.bam > depth.txt #测试参考基因组每个位点或一段区域的测序深度
samtools flagstat /mnt/d/Desktop/YEAST/test.sort.bam > stat.txt #统计比对结果
samtools rmdup /mnt/d/Desktop/YEAST/test.sort.bam nopcr.bam #去除PCR重复
samtools mpileup -gf /mnt/d/Desktop/YEAST/S288C_genomic.fna nopcr.bam > bwa.bcf #生成bcf文件
bcftools 基因变异检测，得到snps.bcf文件
conda install bcftools
bcftools call -vm /mnt/d/Desktop/YEAST/bwa.bcf -o variants.bcf
bcftools view -v snps,indels /mnt/d/Desktop/YEAST/variants.bcf > snps.vcf
bcftools filter -i 'QUAL>20 &&DP>5' /mnt/d/Desktop/YEAST/snps.vcf -o snps.filtered.vcf #变异位点过滤
annovar 变异基因注释，生成variant_function和exonic_variant_function后缀的两个结果文件
convert2annovar.pl -format vcf4 snps.vcf > snps.avinput #生成annovar输入文件
gunzip S288C_genomic.gff.gz #自定义注释数据库
wget http://hgdownload.soe.ucsc.edu/admin/exe/linux.x86_64/gff3ToGenePred
chmod 777 gff3ToGenePred
./gff3ToGenePred -useName /mnt/d/Desktop/YEAST/S288C_genomic.gff refGene.txt #gff3文件转为GenePred文件
cut -f 12 7055-genome_refGene.txt >column1.txt #修改GenePred文件
cut -f 2-15 refGene.txt > column_else.txt
paste column1.txt column_else.txt >new_refGene.txt
retrieve_seq_from_fasta.pl #为建立每个基因与编码序列对应文件
cp 7055-genome_new_refGene* ~/BioSofts/annovar/humandb/#拷贝数据库文件到annovar安装目录humandb文件夹
annotate_variation.pl --geneanno --dbtype refGene --buildver 7055-genome_new snps.avinput ~/BioSofts/annovar/humandb/ #注释变异基因位点
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重测序分析一般流程
