7月5日
动物样品的采集,保存和运输
1.检测的准确性
保障条件 人机料法环(5个方面）
前提条件 合格的样品
最合适的样品 抗凝血 （不必要血清）
2.采样的五个原则
先排除，后采样
合理时机 (死亡 2h内 夏天 6h )
无菌环境（工具消毒）
合理采样（根据目的选择方法）
保护自己，爱护动物
3.采样准备.
人员 (熟悉动物防段的有关法律规定，具有一定专业知识；边练掌握采样工作程序和操作技术；不得少于2人. 至少一人为专业机构人员)
器械和防护物品
采样单
4.样品类型和采样方法
血液样品 （无菌操作）
组织样品
其它样品
5.样品送检
采样记录
样品包装 3层（采样单 单独密封）
保存与运输 防倾斜 （全血远离冰块，血清可以）
6.样品采集和检测中生物安全要求
穿着顺序 口罩 →帽子 →防护服→防护目镜 →鞋套→手套（两层)
反之顺序 防护目镜→防护服→手套→帽子 →鞋套 →口罩
7.样品的检测
人员防护
样品处理 样品接收、开箱、外理后的余样、废弃物、器械、生物安全柜每步消毒
处理样品、提取、反应液配制(核酸提取反应液配制环节两个房间内进行、注意手套要换）
废弃物处理密封、生物垃圾袋（高压消毒）集中外理
样品的接收、制备和留样
1.样品的接收
登记→对接→确认信息
注意 信息详细，状态清晰，有效引导，明确可追溯
2.常见问题的避免
血样 寄送时未放置填充物，导致样品溶血，无法进行相关检测且费时费力无结果；寄送时血清未析出就用两个冰袋将血样包裹，导致血样温度过低冷冻溶血；样品量过少，无法满足所有的检测项目。
组织 新鲜组织寄送时不加冰袋，导致样品腐败；固定组织寄送时加冰，导致细胞收缩，无法观察细胞状态。
棉拭 离心管或密封袋密封不严，导致棉拭液流出，污染样品；干棉拭直接寄送，未加保存液或缓冲液，可能导致结果阴性；
标记 样品标记不清，且采样不留底，导致样品接收后无法核对并进行检测
3.组织样品的制备
新鲜组织，找到目标病变(健康与病变位置交界处)地方取样，3点取样，每个点位置均一分为二，一份检测一份留样。
称取0.5g样品，在无菌操作下，加入1ml灭菌生理盐水(或者PBS)，放入组织研磨仪中研磨后离心(注意配平)。
4.血液样品的制备
测核酸的样品直接用无菌吸管或一液器吸取血样，转移至无菌离心管中；用于抗体检测的需将全血离心后小心吸取上清液。(一分为二做好标记，不能及时进行检测，短时间冷长，长时间冷冻)
5.其他样品的制备
棉签、纱布拭子样品 一次性注射器加入适量生理盐水或PBS至离心管，离心后取上清液。
精液样品 取上清液转入离心管中，进行两次反复冻融后待测。
粪便样品 挑取少许样品，加入适量生理盐水，振荡、混匀、离心取上清液。
水样 直接用无菌吸管吸取上层液体，转移至离心管待测。
蛋清类 弃去粘稠蛋清和蛋黄，直接吸取，手不要接触，防止污染
蛋黄类 弃蛋清，直接吸取，注意不要吸取蛋清
(均为两份，测定与留样)
6.注意事项
消毒与无菌操作，注意个人防护，在生物安全柜中操作区铺隔水垫且注意其消毒，制好的样品的灭活与消毒；废弃物处理的无害化与重复使用器械注意消毒；样品溢洒后保护人身安全后有效消毒。
7.实验结束后的处理
注意环境消毒与用具的消毒
8.样品的留样
常规样品按各自储存要求存放，出报告15天后可自行处理；有特别要求的样品视情况而定；新鲜组织可检测完毕后集中消毒处理，不进行留样。
9.留样的作用
试验有误差或检测样品出现问题时进行复查；客户有异议时可进行复查；应体系要求，体系闭环，环节可追溯；随时追加项目、验证，留存有意义的生物样本。
禽病常见实验检测方法介绍、检测方案制定及结果分析
1.病毒的增殖只能在活细胞中进行，以病毒基因为模板在酶的作用下分别合成其基因，再组装完成完整的病毒粒子。所以疫苗分为灭活疫苗与活疫苗，区别是病原在体内是否可以增殖。
2.凝集试验的原理 细菌、螺旋体、红细胞等颗粒性抗原，或吸附在红细胞、乳胶颗粒性载体表面的可溶性抗原，与相应抗体结合后，再有适量电解质存在的情况下，抗原颗粒相互凝集成肉眼可见的凝集块。
3.凝集实验的注意要点
样品 全血可做(方便)，血清亦可
方法 ELISA常用较快，但不能替代血凝与血抑
4.实验室检测方案的制定
雏鸡母源抗体检查(追溯根源)
免疫检查(注意检查节点)
生产发生变动检查(数值突然变动)
主要疫病流行动态分析(大量分析)
5.常见禽病实验室检测数据分析
若一周抗体变化超过30%→抗体急剧升高，可确认鸡群感染
变异系数增大，鸡群感染抗体下降
6.免疫标记技术 常用间接伊莱莎，可用一种酶标二抗检测各种与抗原相应的一抗，但交叉反应高，反应本底高；阻断伊莱莎，特异性好，但线性关系不好，具有特殊性。
7.病理取材 取病变与正常组织交接处，脾脏应取掉皮膜从中间分开，固定于浓度为10%的福尔马林(实验前后均不可冷冻，若冷冻切片将组织放在0~4℃的容器中，不可解冻，尽快实验)
非洲猪瘟核酸检测原理、操作和全流程质控要点
1.非洲猪瘟的特点
影响所有年龄的猪，表现为皮上皮下出血；根据性状分类多，猪科所有都易感，但仅对家猪易致病。
2.非洲猪瘟的传播途径
猪体分泌物，血液，猪肉，脏器及污染物，泔水，车辆，饲料，饮水，气溶胶等。
3.非洲猪瘟的病原特征
基因组大，基因型多，唯一通过节肢动物传播的DNA病毒，国内流行基因二型，基因一型被动流行。
4.非洲猪瘟的细胞嗜性特点
多组织嗜性，内皮细胞(内壁)，巨噬细胞(肺)。
5.荧光PCR检测原理
根据DNA与RNA特有的碱基互补配对，半保留复制。
6.PCR检测技术
普通PCR-定性、荧光PCR-相对定量、数字PCR-绝对定量三者检测灵敏度逐渐上升
7.科学采集PCR待测样品
采血浆，不能溶血， 减少影响因子
8.PCR莹光操作规程，每个实验室不一样，找到适合自己的。
9.处理废弃物
废液缸 废液桶(有效的消毒液) 高压灭菌锅(内排式)
10.核酸检测分区设计(正负压分开)，安全生物柜放在回风口附近。
11.核酸检测操作五字诀
温，混，纯，准，稳。
血清学检测原理、操作和异常问题分析
1.ELISA原理 ELISA是免疫技术与酶催化放大信号相结合的技术，待检物与固相载体表面的抗原或抗体结合。洗板除去非结合物，再加入酶标记的抗原或抗体，此时，能固定下来的酶量与样品中被检物质的量相关。再通过加入与酶反应的底物显色，根据颜色的深浅可以判断样品中物质的含量，进行定性或定量的分析。
2.固相载体的要求
结合抗体与抗原的容量较大
抗体或抗原能牢固地固定在其表面
不影响抗体或抗原的免疫反应性
3.酶联实验的原理 蛋白质暴露在表面的侧链氨基酸能与固体载相表面的疏水基团发生作用，从而吸附于微孔版表面。
4.ELISA的检测方法类型
测定抗原的方法 双抗体夹心法，双位点一步法，竞争法。
测定抗体的方法，间接法，双抗原夹心法，竞争法，捕获法。
5.ELISA操作注意事项
每个试剂使用前摇匀
样品的稀释倍数高时，采用分步稀释法
实验顺序不要乱，注意枪头的更换，每次要混匀
洗涤时甩干要直立，有气泡用枪头可刺破，但不能触到反应底部
6.血凝现象的原理 病毒表面的血凝素与红细胞表面受体结合，从而凝集的现象。
7.HA实验结果的判定(HI相反)
完全凝集红细胞呈散装，均匀分布于孔底；不完全凝集介于两者之间；完全不凝集红细胞呈明显纽扣状底部
8.血凝效价 能使红细胞发生完全凝集的病毒最大稀释倍数
9.4HAU 根据抗原效价结果匹配相应比例的抗原稀释液即病毒的血凝效价除以四
动物临床病料细菌分离鉴定、药敏试验及相关检测技术
1.实验目的
细菌分离(临床发病动物病原体诊断，细菌病诊断的金标准)
药敏试验(指导临床科学用药，防止抗生素滥用)
2.培养期的选择依据
样本的类型，客户的需求
3.平板的划线与培养
分区划线法用于含菌量较多的标本，目的为分离出单个的菌落。
连续划线法用于含菌数量较少的标本。
注意平板表面划线的连续与不重复，接种环与琼脂表面有15－20的斜度，力度轻柔。
4.酶类试验的注意点
氧化酶实验不能用铁接种环
触酶实验与氧化酶实验新鲜培养不能用血平板
5.致病菌确定原则
常见动物致病菌；同一动物，不同组织与同一场所不同个体动物均检出的菌；数量多，优势菌；结合发病动物临床症状，确定原发病原或继发病原
6.药敏实验原理
将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种待检菌的琼脂平板上，纸片中含有的药物吸取琼脂中的水分溶解后会不断的向纸片周围区域扩散，形成递减的浓度梯度。在纸片周围抑菌浓度范围内待检菌的生长被抑制，从而产生透明的抑菌圈。
7.菌悬液的制备
选择生长良好的单菌或纯化后的菌台；用接种环挑取菌落在瓶壁充分研磨，再与生理盐水充分混合；选择适宜比浊管进行比对；尽量减少外界视线误差
8.平板的涂布
选择湿润但无液体滴下的平板60度旋转涂布，确保接种液涂抹均匀，最后在平板边缘涂抹一圈。
9.药敏结果观察与判定
在透射光下，用游标卡尺量取各纸片的抑菌圈直径，不规则抑菌圈取最大和最小直径平均值，无法读取直径的读半径乘2，双抑菌圈以内圈直径为判定结果。将抑菌圈直径与标准对比。
7月6日
